使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒。本发明专利技术提供了一种用肝细胞制备胰岛素分泌细胞的方法，包括如下步骤：将Casilio体系的三个功能元件的编码DNA导入肝细胞，得到重组细胞，即为胰岛素分泌细胞。所述Casilio体系的三个功能元件为dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA，与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成，12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。本发明专利技术为胰岛细胞再生提供了一种新的研究思路和技术手段，对糖尿病的临床治疗奠定了实验基础，具有临床应用价值。具有临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种用于使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]糖尿病是患者体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的慢性代谢性疾病。异体胰岛移植是目前最有可能治疗糖尿病的方法之一，但胰岛供体缺乏和免疫排斥反应限制了其临床应用。
[0003]细胞直接重编程是将一种已分化的细胞不经过去分化与再分化直接转分化为另一种细胞，肝脏和胰腺共同起源于腹部前肠内胚层，决定了肝脏与胰腺细胞具有相互转化的可能性。在体外实现肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程中最关键的诱导因素是激活胰腺转录因子表达。Akinci等从胰腺β细胞发育相关的20个转录因子中筛选出三个转录因子Pdx1、Ngn3、MafA(PNM)，通过逆转录病毒直接将外分泌细胞重编程为胰岛样细胞。Banga等将PNM转录因子组合串联腺病毒经尾静脉注入小鼠体内，发现仅在肝脏出现胰岛素分泌细胞(Insulin-producing Cells,IPCs)。因此PNM等胰腺发育关键转录因子常被作为肝细胞直接重编程为胰腺β细胞的目标基因。目前细胞直接重编程的效率和成熟度均较低，传统的重编程方法无法有效开启胰岛细胞相关内源基因的调控网络，获得的细胞不能满足临床治疗的需求。
[0004]CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats Cas9)技术是继锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、转录激活样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)之后重要的新型基因编辑技术。Casilio系统是由dCas9蛋白，附带有一个或以上PUF结构域结合位点的一条sgRNA(sgRNA-PBS)，和与PUF结构域融合的一个效应蛋白(PUF融合蛋白)所构成。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于使肝细胞直接重编程为胰岛样细胞的方法和试剂盒。
[0006]本专利技术提供了一种用肝细胞制备胰岛素分泌细胞的方法，包括如下步骤：将Casilio体系的三个功能元件的编码DNA导入肝细胞，得到重组细胞，即为胰岛素分泌细胞。
[0007]本专利技术还提供了一种使肝细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞的方法，包括如下步骤：在肝细胞中导入Casilio体系的三个功能元件的编码DNA。
[0008]本专利技术还保护一种重组细胞，其制备方法包括如下步骤：将Casilio体系的三个功能元件的编码DNA导入肝细胞，得到重组细胞。
[0009]本专利技术还保护一种试剂盒，包括Casilio体系的三个功能元件或Casilio体系的三个功能元件的编码DNA或含有Casilio体系的三个功能元件的编码DNA的重组表达载体；所述试剂盒的功能为用肝细胞制备胰岛素分泌细胞。所述试剂盒还可包括PiggyBac转座酶或PiggyBac转座酶的编码DNA或含有PiggyBac转座酶的编码DNA的重组表达载体。
[0010]本专利技术还保护Casilio体系的三个功能元件或Casilio体系的三个功能元件的编码DNA或含有Casilio体系的三个功能元件的编码DNA的重组表达载体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为用肝细胞制备胰岛素分泌细胞。
[0011]以上任一所述Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA、与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成，12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。
[0012]与PUF结构域融合的效应蛋白为与PUF结构域融合的转录激活因子。
[0013]Casilio体系的三个功能元件的编码DNA可以同时导入肝细胞，也可以分步导入肝细胞。
[0014]具体的，先导入dCas9蛋白的编码DNA，再导入与PUF结构域融合的效应蛋白的编码DNA，再导入附带有PUF结构域结合位点的sgRNA的编码DNA。
[0015]具体的，为了促进外源DNA整合到细胞的基因组DNA，导入dCas9蛋白的编码DNA的同时导入PiggyBac转座酶的编码DNA。
[0016]具体的，为了促进外源DNA整合到细胞的基因组DNA，导入与PUF结构域融合的效应蛋白的编码DNA的同时导入PiggyBac转座酶的编码DNA。
[0017]具体的，dCas9蛋白的编码DNA在细胞中诱导型表达。所述诱导型表达为基于tet-on系统的诱导型表达。
[0018]具体的，与PUF结构域融合的效应蛋白的编码DNA在细胞中诱导型表达。所述诱导型表达为基于tet-on系统的诱导型表达。
[0019]具体的，dCas9蛋白的编码DNA通过重组表达载体导入细胞。所述重组表达载体具体可为PMax-NLS-dCas9质粒或PB3-pmax-dCas9质粒。
[0020]具体的，与PUF结构域融合的效应蛋白的编码DNA通过重组表达载体导入细胞。所述重组表达载体具体可为Pmax-NLSPUFa_p65-HSF1质粒或PB3-neo(-)-pmax-NLSPUFa_p65-HSF1质粒。
[0021]具体的，PiggyBac转座酶的编码DNA通过重组表达载体导入细胞。所述重组表达载体具体可为PiggyBac质粒。
[0022]12种sgRNA依次命名为Pdx1-sgRNA1、Pdx1-sgRNA2、Pdx1-sgRNA3、Pdx1-sgRNA4、Ngn3-sgRNA1、Ngn3-sgRNA2、Ngn3-sgRNA3、Ngn3-sgRNA4、MafA-sgRNA1、MafA-sgRNA2、MafA-sgRNA3、MafA-sgRNA4。
[0023]具体的，12种sgRNA的编码DNA通过相应的12种重组表达载体导入细胞。所述12种重组表达载体为实施例中的重组质粒Pdx1-gRNA1、重组质粒Pdx1-gRNA2、重组质粒Pdx1-gRNA3、重组质粒Pdx1-gRNA4、重组质粒Ngn3-gRNA1、重组质粒Ngn3-gRNA2、重组质粒Ngn3-gRNA3、重组质粒Ngn3-gRNA4、重组质粒MafA-gRNA1、重组质粒MafA-gRNA2、重组质粒MafA-gRNA和重组质粒MafA-gRNA4。12种重组表达载体的出发载体均为pX-sgRNA-5xPBSa质粒。
[0024]含有Casilio体系的三个功能元件的编码DNA的重组表达载体具体可为含有dCas9蛋白的编码DNA的重组表达载体、含有与PUF结构域融合的效应蛋白的编码DNA的重组表达载体和含有附带有PUF结构域结合位点的sgRNA的编码DNA的重组表达载体。附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成，12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。相应的，含有附带有PUF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用肝细胞制备胰岛素分泌细胞的方法，包括如下步骤：将Casilio体系的三个功能元件的编码DNA导入肝细胞，得到重组细胞，即为胰岛素分泌细胞；Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA、与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成；12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。2.一种使肝细胞向胰岛素分泌细胞直接重编程的方法，包括如下步骤：在肝细胞中导入Casilio体系的三个功能元件的编码DNA；Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA、与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成；12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。3.一种重组细胞，其制备方法包括如下步骤：将Casilio体系的三个功能元件的编码DNA导入肝细胞，得到重组细胞；Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA、与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成；12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示。4.一种试剂盒，包括Casilio体系的三个功能元件或Casilio体系的三个功能元件的编码DNA或含有Casilio体系的三个功能元件的编码DNA的重组表达载体；Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF结构域结合位点的sgRNA、与PUF结构域融合的效应蛋白；附带有PUF结构域结合位点的sgRNA由12种sgRNA组成；12种sgRNA的靶序列依次如序列表的序列1至序列12所示；所述试剂盒的功能为用肝细胞制备胰岛素分泌细胞。5.Casilio体系的三个功能元件或Casilio体系的三个功能元件的编码DNA或含有Casilio体系的三个功能元件的编码DNA的重组表达载体在制备试剂盒中的应用；Casilio体系的三个功能元件为：dCas9蛋白、附带有PUF...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓菲，李富荣，王晗月，
申请(专利权)人：深圳市人民医院，
类型：发明
国别省市：