结直肠癌类器官培养基及无支架3D培养方法技术

本发明专利技术公开了一种结直肠癌类器官培养基及无支架3D培养方法，涉及生物技术领域，本发明专利技术公开了一种结直肠癌类器官培养基及无载体支架支持下三维结直肠癌肿瘤类器官细胞球培养方法。本发明专利技术的培养基针对结直肠癌患者组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照优化比例配制而成，其组分简单合理，营养丰富。本发明专利技术方法在不引入外源性支撑材料的前提下，实现了结直肠癌肿瘤类器官的构建及培养，成功率可达90%以上，能够有效保持原代肿瘤细胞特异性，并可长期维持肿瘤细胞活力和功能性高表达，可为体外药物敏感性检测、新药研发及疾病相关机制研究提供理想模型。发及疾病相关机制研究提供理想模型。发及疾病相关机制研究提供理想模型。

【技术实现步骤摘要】
结直肠癌类器官培养基及无支架3D培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种结直肠癌类器官培养基及无支架3D培养方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤发病率中已位居第三位，仅次于肺癌和胃癌，死亡率居第五位，已高于发展中国家以及世界平均水平。结直肠癌发病最多的年龄段是40～49岁，结直肠癌早期常无特殊症状，所以，通常发现时患者已经是中晚期。目前结直肠癌的治疗方式主要还是依靠手术和放、化疗，虽然生物制剂、免疫治疗等辅助治疗正在不断出现，但疗效依然较为有限。以往结直肠癌的研究主要依靠细胞模型和动物模型，但这些模型都存在一定的局限性。而近年来出现的类器官模型使得我们可以在体外更加高效且真实地模拟肿瘤在体内的各方面特性，为基础研究及其向临床应用的转化提供了更加可靠的工具和桥梁。
[0003]与单一因素驱动的肿瘤相比，结直肠癌的突出特点是患者间的遗传和表型异质性，其发病机制呈多样化。肿瘤类器官作为一种新的实验模型，在结直肠癌机制研究、基因组学研究、抗肿瘤药物筛选、肿瘤动物模型建立等方面发挥重要作用。2007年，荷兰克莱弗斯实验室的Barker N等人研究发现携带有LGR5受体的细胞产生小鼠肠道的所有细胞，Wnt信号通路中的分子指引这些细胞分裂。2009年，荷兰Sate T等利用小鼠肠道上皮隐窝底部Lgr5
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柱状细胞，在基质胶中培养出类器官；2011年Jung等人用相同的方法将人结直肠黏膜中EphB2高表达的细胞培养成结直肠类器官，同年Sato T等人成功培养了源自患者肿瘤组织的结直肠肿瘤类器官。体外构建患者来源的结直肠癌肿瘤类器官，可在体外模拟体内3D生长环境，与传统的2D培养体系相比，3D培养体系能够更加真实反映肠道功能及体内的信号传导及形态，并且与原发肿瘤具有高度的组织一致性。因此，肿瘤类器官成为目前科学家们的关注热点，用于结直肠癌的发生发展病理机制研究及抗肿瘤药物的体外筛选。但是目前常规的结直肠癌肿瘤类器官培养体系基本延续了Sato T等人建立的方法，借助基质胶、水凝胶等外源基质材料进行3D细胞培养，但是这种培养体系具有一定的局限性，由于外源基质的存在限制了类器官与外界的气体交换和物质代谢，当类器官形成较大的组织后，循环系统的缺乏和氧气养分交换的局限性严重影响了类器官所需营养物质的吸收以及代谢废物的清除；并且因3D细胞球周围有外源基质而无法进行原位光学检测，而去除外基质的过程不仅繁琐，一定程度上还会对细胞活性造成影响，干扰实验结果的真实性。
[0004]中国专利申请(申请号为202110109040.X)公开了一种用于结直肠癌类器官培养的培养液及其制备方法，该技术专利技术所涉及的培养液包含多种细胞因子、信号通路调控因子、氨基酸和无血清添加剂等，由17种原料组成；基于该培养液所构建的类器官采用的是培养液和基质胶按体积比为3∶4接种细胞，每个胶滴40
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60μL，然后置于37℃，5％CO2条件下培养，获得结直肠癌类器官。
[0005]中国专利申请(申请号为202011052642.8)公开了一种人结直肠癌肿瘤类器官的
培养方法及其应用，该技术专利技术公布的类器官培养方法涉及培养液包含细胞因子、信号通路调控因子、抗生素和无血清添加剂等十多种原料。该专利技术所涉及的类器官构建方法是将获得细胞团与水凝胶混合，固化后加入人结直肠癌类器官培养液进行培养，获得人结直肠癌类器官。
[0006]中国专利申请(申请号为202011211090.0)公开了一种结直肠癌类器官的培养方法和培养液，该技术专利技术所涉及的培养基用自产Wnt
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3a、R
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Spondin1和Noggin的细胞系替代三种昂贵细胞因子加入，节约了类器官的培养成分。但该专利技术所涉及的类器官构建方法仍需引入基质胶，将细胞混悬液和基质胶按照体积比为1∶1.5
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3混合，所得混合物接种后进行培养，获得类器官。
[0007]上述三个专利所涉及的类器官构建培养方法仍采用的是常规基于基质胶或水凝胶等引入外源基质的培养体系。
[0008]针对上述类器官培养中需要引入外源支架材料，导致细胞生长不良、支架材料去除困难等缺陷，以及获得的类器官模型大小不均匀，可能存在不同药物相应等问题。

技术实现思路

[0009]专利技术目的在于提供一种结直肠癌类器官培养基。
[0010]所涉及培养基组成简单，配方合理，营养丰富，能满足结肠癌类器官细胞球的稳定生长；本专利技术所建立的无支架类器官构建方法，可快速形成类器官，且大小均一，细胞球紧密聚集，表面光滑圆润，边界清晰，遗传及生物学性状稳定。本专利技术所建立的结直肠癌患者体外瘤类器官模型，可用于体外药物敏感性评价，为患者的个体化治疗方案的制定提供有效的实验数据参考。
[0011]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种结直肠癌类器官培养基，培养基成分包括：青霉素、链霉素、ROCK1抑制剂、MAPK抑制剂、ALK
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5抑制剂、R
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Spondin
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1、HEPES、GlutaMAX、B
‑
27、N
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2、EGF、Noggin、胃泌素(Gastrin I)和Advanced DMEM/F12基础培养基。
[0012]优选的，上述的结直肠癌类器官培养基中基础培养基是Advanced DMEM/F12培养基。
[0013]优选的，上述的结直肠癌类器官培养基中ROCK1抑制剂为Y
‑
27632。
[0014]优选的，上述的结直肠癌类器官培养基中MAPK抑制剂为SB202190。
[0015]优选的，上述的结直肠癌类器官培养基中ALK
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5抑制剂为A83
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01。
[0016]进一步的，上述结直肠癌类器官培养基，具体为用于结直肠癌无支架类器官3D细胞球培养的培养基，由以下浓度或体积百分比的成分组成：表1结直肠癌无支架类器官培养基组成
本专利所专利技术的结直肠癌类器官培养基成分的主要作用如下：双抗(青霉素/链霉素)抑制细菌生长，降低肿瘤细胞培养过程中染菌的可能；Y
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27632为ROCK抑制剂，具有防止细胞凋亡的作用；A83
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01为TGF
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β1受体抑制剂，加入培养基发挥维持细胞干性，抑制细胞分化的作用；SB202190是一种有效的p38 MAPK抑制剂；R
‑
Spondin
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1通过激活并协同Wn/β
‑
catenin信号通路参与调控细胞增殖和分化；HEPES是一种缓冲液，用于维持培养基稳定的pH值；GlutaMAX是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L
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谷氨酰胺，可以防止在长期培养过程中谷氨酰胺的降解和最大限度减少毒性氨成分的蓄积，改善细胞活性；B...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌类器官培养基，其特征在于，该培养基成分至少包括：青霉素、链霉素、ROCK1抑制剂、MAPK抑制剂、ALK
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5抑制剂、R
‑
Spondin
‑
1、HEPES、GlutaMAX、B
‑
27、N
‑
2、EGF、Noggin、胃泌素(Gastrin I)和AdvancedDMEM/F12基础培养基。2.根据权利要求1所述的结直肠癌类器官培养基，其特征在于：其中各成分的使用量为：0.5
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2％青霉素、0.5
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2％链霉素、5
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20μM ROCK1抑制剂、5
‑
20μM MAPK抑制剂、0.5
‑
1μMALK
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5抑制剂、0.2
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1μg/mL R
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Spondin
‑
1、1
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3％HEPES、0.5
‑
3％GlutaMAX、1
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3％B
‑
27、0.5
‑
2％N
‑
2、0.01
‑
0.1μg/mL EGF、0.05
‑
0.5μg/mL Noggin、5
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50nM胃泌素(Gastrin I)、余量均为Advanced DMEM/F12基础培养基。3.根据权利要求1所述的结直肠癌类器官培养基，其特征在于：所述ROCK1抑制剂为Y
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27632。4.根据权利要求1所述的结直肠癌类器官培养基，其特征在于：所述MAPK抑制剂为SB202190。5.根据权利要求1所述的结直肠癌类器官培养基，其特征在于：所述ALK
‑
5抑制剂为A83
‑
01。6.一种结直肠癌类器官培养基无支架3D培养方法，其特征在于：至少包括以下方法步骤：S01、将经消化分离的原代肿瘤细胞直接接种至超低吸附的细胞培养孔板中；S02、加入如权利要求1～5任一所述的结直肠癌类器官培养基；S03、每隔2～3天更换一次培养基，培养至形成类器官。7.根据权利要求6所述的结直肠癌类器官培养基无支架3D培养方法，其特征在于：所述步骤S01中，原代肿瘤细胞的分离消化方法是取肿瘤组织冲洗干净，剪成块，加入单细胞悬液制备仪酶解肿瘤组织，分离获取原代细胞；其中，单细胞悬液制备仪的设定水浴温度为38.5℃，仪器转速为150rpm，顺时针、逆时针分别运转5min。8.根据权利要求7所述的结直肠癌类器官培养基无支架3...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗国安，范雪梅，王义明，尤金枝，
申请(专利权)人：浙江弘瑞医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：