一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用，该引物组合由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB组合而成；将上述引物组合应用于实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)技术，能实现对乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌进行检测。本发明专利技术的引物组合特异性强、检出极限低；本发明专利技术的检测方法中外引物、内引物和环引物的终浓度比例适宜，适用于乳制品的质量检测，能够特异、灵敏且快速检测乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌。克罗诺杆菌。

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用


[0001]本专利技术属于乳制品质量检测
，涉及一种引物组合及应用，具体地说是一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。

技术介绍

[0002]阪崎克罗诺杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身分布着有动力的鞭毛，多数产黄色素，是乳制品中的一种污染菌，能够快速且大量在婴儿配方奶粉及其它乳制品中繁殖。它对早产、出生体重轻及患病婴儿等免疫能力较弱的婴儿具有较大威胁，能引起新生儿败血症、脑膜炎和坏死性小肠结肠炎，低浓度的阪崎克罗诺杆菌感染即可导致婴幼儿患病。因此，加强对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测力度极其重要。
[0003]对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测离不开基因扩增。环介导等温扩增(Loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)技术是一种新型核酸扩增技术，其原理是针对靶基因的6个区域设计4条或6条引物，利用置换链DNA聚合酶在等温条件下保持1h左右，即可完成扩增，可通过观察扩增产物的荧光颜色或浊度变化进行结果判读。实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)是在LAMP反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号来实时监控LAMP反应的进程，具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。
[0004]传统的食品中阪崎克罗诺杆菌的检测步骤复杂且周期较长，一般需要5天以上才能得到结果，且结果准确性和特异性都不高，易产生假阳性结果，需要反复验证，而目前没有特异性强且检出极限低的阪崎克罗诺杆菌RealAmp检测体系。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的，是提供一种引物组合及其在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用，基于阪崎克罗诺杆菌gyrB基因设计特异性引物组合及RealAmp反应体系，达到通过应用于RealAmp技术，实现特异性强、检出限低且能快速检测乳制品中是否含有阪崎克罗诺杆菌的目的。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0007]一种引物组合，由外引物、内引物和环引物组合而成，所述外引物、内引物和环引物及其序列分别为：
[0008]外引物F3：5
’‑
CCGTTAAAGTGCC
‑3’
、
[0009]外引物B3：5
’‑
GCTTTACGTGCCGC
‑3’
、
[0010]内引物FIP：5
’‑
TGCTGCTCAACCGCCGATTTCTCCTCCCAGACCAAAGACA
‑3’
、
[0011]内引物BIP：5
’‑
GATGAACGAGCTGCTGGCCGTCGATAATTTTGCCGA
‑3’
、
[0012]环引物LF：5
’‑
CACCTCGGAGGAGACC
‑3’
和
[0013]环引物LB：5
’‑
CTGCTGGAGAACCC
‑3’
。
[0014]本专利技术还提供了一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。
[0015]作为一种限定，所述一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法，
是以模板为待测乳制品中的DNA、引物为所述的一种引物组合的RealAmp反应体系进行反应，实时监测荧光强度，反应结果呈阳性则待测样品中含阪崎克罗诺杆菌，反应结果呈阴性则待测样品中不含阪崎克罗诺杆菌。
[0016]作为进一步限定，所述RealAmp反应体系，以物质的量份数计，包括0.1
‑
0.4份所述外引物F3、0.1
‑
0.4份所述外引物B3、1.1
‑
1.5份所述内引物FIP、1.1
‑
1.5份所述内引物BIP、0.5
‑
1.2份所述环引物LF、0.5
‑
1.2份所述环引物LB，还包括0.4
×
103‑2×
103份dNTPs和0.2
×
106‑
0.5
×
106份甜菜碱。
[0017]所述RealAmp反应体系还包括灭菌蒸馏水，在RealAmp反应体系加入灭菌蒸馏水至总体积为25体积份；体系中还包括终浓度为4mmol/L的硫酸镁、0.5
‑
1.5体积份模板、1.3体积份Bst DNA聚合酶大片段(8U)、2.5体积份10
×
BST DNA聚合酶反应缓冲液和0.3体积份1:300的SYBRgreenl。
[0018]作为第二种限定，所述外引物、所述内引物和所述环引物的终浓度比为1:7:3。
[0019]作为第三种限定，所述反应的温度为50
‑
70℃。
[0020]由于采用了上述的技术方案，本专利技术与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
[0021]本专利技术的引物组合是基于gyrB基因，通过分析阪崎克罗诺杆菌菌种特征，设计所得的特异性引物组合，将所设计引物应用于实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)技术，实现对乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测；该引物特异性强、检出限仅4.3
×
101CFU/mL，表明灵敏度极高，该方法能够特异、灵敏且快速检测乳制品中是否阪崎克罗诺杆菌；
[0022]本专利技术的检测方法中，通过调整体系中各组分的浓度，尤其优化外引物、内引物和环引物的终浓度比例为1：7：3，显著提高检测结果精确度，相较于荧光定量PCR的1
‑
1.5h扩增程序及realAMP的0.5
‑
0.6h反应时间，本专利技术的方法更高效。
[0023]综上所述，本专利技术的引物适用于实时荧光环介导等温扩增(RealAmp)技术，本专利技术的方法适于在乳制品工业生产中，检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌。
[0024]下面结合附图及具体实施例对本专利技术作更进一步详细说明。
附图说明
[0025]图1为实施例3中RealAmp反应荧光强度结果图；
[0026]图2为实施例3中RealAmp反应解离温度验证结果图；
[0027]图3为实施例3中RealAmp反应外引物和内引物终浓度比例验证结果图；
[0028]图4为实施例3中RealAmp反应外引物和环引物终浓度比例验证结果图；
[0029]图5为实施例9中RealAmp反应检测极限结果图。
具体实施方式
[0030]实施例1一种引物组合
[0031](一)引物设计
[0032]gyrB基因序列为阪崎克罗诺杆菌保守序列，根据gyrB基因序列设计引物，可特异性扩增阪崎克罗诺杆菌，而不会出现对其它菌的非特异性扩增。
[0033]根据Genebank中的阪崎克罗诺杆菌基因序列，进行比对，确定阪崎克罗诺杆菌(该菌购自美国模式培养物保藏所，编号为：ATCC2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种引物组合，由外引物、内引物和环引物组合而成，其特征在于，所述外引物、内引物和环引物及其序列分别为：外引物F3：5
’‑ꢀ
CCGTTAAAGTGCC
ꢀ‑3’
、外引物B3：5
’‑ꢀ
GCTTTACGTGCCGC
ꢀ‑3’
、内引物FIP：5
’‑ꢀ
TGCTGCTCAACCGCCGATTTCTCCTCCCAGACCAAAGACA
ꢀ‑3’
、内引物BIP：5
’‑ꢀ
GATGAACGAGCTGCTGGCCGTCGATAATTTTGCCGA
ꢀ‑3’
、环引物LF：5
’‑ꢀ
CACCTCGGAGGAGACC
ꢀ‑3’
和环引物LB：5
’‑ꢀ
CTGCTGGAGAACCC
ꢀ‑3’
。2.权利要求1所述的一种引物组合在检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述一种引物组合用于检测乳制品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法，是以模板为待测乳制品中的DNA、引物为所述的一种引物组合的RealAmp反应体系进行反应，实时...

【专利技术属性】
技术研发人员：王世杰，杨婉秋，胡连霞，张树飞，袁庆彬，薛玉玲，冯丽莉，荀一萍，张栋，
申请(专利权)人：石家庄君乐宝乳业有限公司，
类型：发明
国别省市：