提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高纤维素酶活的基因、蛋白和菌株，基因为trans1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；菌株为黑曲霉Trans，由pCAMBIA1300

【技术实现步骤摘要】
提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物和动物中药饲料
，更具体地说是涉及提高纤维素酶活的基因及在中药饲料添加剂中的应用。

技术介绍

[0002]长期以来，化学药品、抗生素和激素的毒副作用和耐药性一直都是困扰医学专家的重要因素，尤其是容易引起动物产品药物残留，这已成为一个全社会关注的问题。中药的毒副作用小，无耐药性，不会在肉、蛋、奶等畜产品中产生有害残留，是中药添加剂的一个独特优势，这一优势，顺应了时代潮流，满足了人们回归自然、追求绿色食品的愿望。
[0003]中药具有营养和药物的双重作用，其内含有多种成分，包括多糖、生物碱、苷类等。中药在动物肠道内，要发挥药效，活性成分必须从组织中释放出来。但是中药活性成分往往被纤维素等包裹，因此，降解纤维素成为中药有效成分释放的关键。现有的纤维素酶虽然能够降解纤维素，但是活性较低。
[0004]纤维素酶的生产需要有安全无毒的高效表达纤维素酶的菌株。黑曲霉菌株是饲料添加剂目录里面的菌株，其具有营养简单，生长繁殖快，安全无毒等优点。
[0005]因此，如何提供一种可以提高纤维素酶活的基因，以该基因构建菌株，并将菌株应用于中草药饲料添加剂中是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种基因，该基因编码的蛋白可以对与纤维素酶运输关联的蛋白进行修饰，调节纤维素运输关联蛋白的表达强度，提高酶活。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：<br/>[0008]一种提高纤维素酶活的基因，所述基因为trans1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]一种提高纤维素酶活的蛋白，所述蛋白由trans1基因编码而得，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]一种高产纤维素酶活的菌株，所述菌株为黑曲霉Trans；黑曲霉Trans由pCAMBIA1300
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trans1重组质粒转化至黑曲霉CBS S13.88而得。
[0011]一种高产纤维素酶活的菌株的构建方法，包括下述步骤：
[0012]1)酶切：对pCAMBIA1300质粒和trans1基因进行Sal I和Hind III酶切，多酶切产物电泳、胶回收；
[0013]2)连接：对胶回收产物进行连接，得重组质粒pCAMBIA1300
‑
trans1；
[0014]3)转化、提取：将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，并提取重组质粒；
[0015]4)转化、介导：将提取的重组质粒转化农杆菌中，并以农杆菌介导侵染黑曲霉菌，获得黑曲霉Trans菌株。
[0016]所述的trans1基因在中草药饲料添加剂中的应用。
[0017]所述的蛋白在中草药饲料添加剂中的应用。
[0018]所述的菌株在中草药饲料添加剂中的应用。
具体实施方式
[0019]下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]实施例1
[0021]菌株和试剂
[0022]黑曲霉CBS 513.88，质粒pCAMBIA1300(Biovector)，农杆菌EHA105，大肠杆菌DH5α，限制性内切酶(TakaRA)等。
[0023]合成基因片段1：GTCGAC(SaII酶切位点序列)
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膜泡介导转运蛋白(编码序列SQTrans1；蛋白序列SQTrans1
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amino)
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AAGCTTGG(HindIII酶切位点序列)。质粒提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司
[0024]方法和步骤
[0025]天根质粒DNA小提试剂盒天根生化科技(北京)有限公司
[0026](1)质粒(pCAMBIA1300,购买Biovector)提取
[0027]1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm(13400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0028]2)带有pCAMBIA1300质粒的大肠杆菌DH5α,在LB培养基(酵母提取物5g,胰化蛋白胨10g,氯化钠10g,NaOH调pH至7.0)中37℃培养18h，取2mL培养的菌液，加入离心管中，使用台式离心机，12000rpm(13400
×
g)离心1min，吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
[0029]3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0030]4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。
[0031]5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm(13400
×
g)离心10min。
[0032]6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm(13400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
[0033]7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm(13400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。
[0034]8)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
[0035]9)重复操作步骤8)。
[0036]10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm(13400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
[0037]11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm(13400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0038]质粒pCAMBIA1300、合成基因片段1的酶切和电泳
[0039]往41μL pCAMBIA1300质粒溶液或合成的基因片段溶液，溶液中加入2μL SaII、2μL Hi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高纤维素酶活的基因，其特征在于，所述基因为trans1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种提高纤维素酶活的蛋白，其特征在于，所述蛋白由trans1基因编码而得，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种高产纤维素酶活的菌株，其特征在于，所述菌株为黑曲霉Trans；黑曲霉Trans由pCAMBIA1300
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trans1重组质粒转化至黑曲霉CBS S13.88而得。4.一种高产纤维素酶活的菌株的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：1)酶切：对pCAMBIA1300质粒和t...

【专利技术属性】
技术研发人员：游锡火，王玉万，薛栋升，蒋慧，梁大明，田美华，胡燕，夏胜，王伟，任雅楠，于晶晶，刘佳丽，孙赫，孙哲，刘艳辉，曾徐浩，张耀，齐义清，沈力，游王丹，
申请(专利权)人：中农华威生物制药湖北有限公司，
类型：发明
国别省市：