人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物及核酸基因组检测领域，具体涉及利用等温核酸扩增技术对临床上一种常见的人类疱疹病毒(EB病毒)核酸检测的引物组合和探针。本发明专利技术提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物及核酸基因组检测领域，特别涉及人类疱疹病毒的病 原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein
‑
Barr virus,EBV)是人类疱疹病毒家族中的双链DNA病 毒，可引起多种常见的临床疾病，EBV感染是传染性单核细胞增多症的主要 病因，在儿童中常见，也与B淋巴瘤相关疾病和鼻咽癌密切相关。与其他人 类疱疹病毒一样，EB病毒感染也可引起神经系统感染、呼吸道疾病等。EB 病毒还具有潜伏特性，感染人体后，往往会潜伏于人类B淋巴细胞，当人体 免疫力低下的情况下，容易再激活引发相关疾病，特别是在发育未完全的新 生儿中、患有HIV感染患者和接受器官移植的患者中，严重危害人类的生命 和健康。
[0003]目前，在临床上对EB病毒感染的病原学鉴定主要包括免疫学检测和分子 生物学检测。免疫学检测适合于流行病学调查，但存在有耗时长、窗口期不 稳定等问题。虽然异嗜性凝集试验可以提示EBV感染，但在儿童中往往呈阴 性，影响临床大夫对疾病判断。近几年，定量聚合酶链反应(QuantitativePolymerase chain reaction,qPCR)逐渐成为病原体核酸检测的“金标准”，对病原 体的核酸定量检测，为临床提供早期诊断和可依据的预防治疗。然而，昂贵 且精密的复杂设备在基层应用中难度较大，因此有必要开发一种简单、快速、 方便、适用的核酸检测方法。

技术实现思路
r/>[0004]有鉴于此，本专利技术提供了人类疱疹病毒(EB病毒)的病原体核酸检测引 物探针组合、试剂盒及其应用。本专利技术提供的引物组合与探针，特异性好， 灵敏度高。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了引物探针组合，包括第一引物探针组合和/或第二引物探针 组合；
[0007]所述第一引物探针组合为含有外源性内参的等温核酸扩增体系组合，具 有：
[0008](I).上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
[0009](II).下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
[0010](III).探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
[0011](IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或 添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示 的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0012](V).与(I)、(II)、(III)和/或(IV)所示的核苷酸序列至少有 80％同一性的核苷酸序列；和/或
[0013]所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合，具 有：
[0014](I).上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
[0015](II).下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
[0016](III).探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
[0017](IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或 添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示 的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0018](V).与(I)、(II)、(III)和/或(IV)所示的核苷酸序列至少有 80％同一性的核苷酸序列。
[0019]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物探针组合还包括靶基因探针， 所述靶基因探针具有：
[0020](I).如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
[0021](II).如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获 得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列； 或
[0022](III).与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷 酸序列。
[0023]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述第二引物探针组合为含有内源性 内参的等温核酸扩增体系组合，还包括：
[0024](I).上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
[0025](II).下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
[0026](III).探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
[0027](IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或 添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示 的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0028](V).与(I)、(II)、(III)和/或(IV)所示的核苷酸序列至少有 80％同一性的核苷酸序列。
[0029]基于上述研究，本专利技术还提供了所述的引物组合在制备检测EB病毒的试 剂或试剂盒中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒 为EB病毒。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述检测的扩增温度为39℃， 扩增时间为30min。
[0030]此外，本专利技术还提供了人类疱疹病毒的检测试剂，包括所述的引物探针 组合以及可接受的助剂。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病 毒为EB病毒。
[0031]更重要的是，本专利技术还提供了人类疱疹病毒的检测试剂盒，包括所述的 引物探针组合以及可接受的助剂或载体。在本专利技术的一些具体实施方案中， 所述人类疱疹病毒为EB病毒。
[0032]重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase
‑
aided amplification，RAA) 是近几年新出现的具有我国自主知识产权的等温核酸扩增技术，在病原体核 酸检测领域和单核苷酸多态性检测中被广泛应用，RAA技术在恒温条件下， 体系内的重组酶与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA 上搜索到与之完全匹配的序列时，在单链DNA结合蛋白的作用下，使模板双 链打开，并在DNA聚合酶的作用下，启动模板合成，形成DNA双链，如此 循环重复进而实现指数扩增，反应30min即可快速完成扩增，通过特异性荧 光探针检测，最快几分钟即可判断结果。内部质控(internalcontrol，IC)包 括外源性内参和内源性内参，是核酸检测反应的一个重要的体系监控，在核 酸检测反应体系中引入IC，
实时监测整个反应体系以此避免因操作失误、温 度不当、反应体系混合物不正确、酶活性差或样品基质中存在抑制物质等原 因导致的假阴性结果。外源性内参，是在反应体系或标本中添加一段内参模 板。内源性内参采用来源于样本中的人类基因组，使用不同的引物对对靶基 因和人运行基因分别进行扩增检测，更重要的是，可以对核酸提取到结果判 读整个过程进行实时监控，不仅对扩增反应进行监控，还能够对样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物探针组合，其特征在于，包括第一引物探针组合和/或第二引物探针组合；所述第一引物探针组合为含有外源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：(I).上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和(III).探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或(IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V).与(I)、(II)、(III)和/或(IV)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；和/或所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：(I).上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和(III).探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或(IV).如(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)、(II)和/或(III)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(V).与(I)、(II)、(III)和/或(IV)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括靶基因探针，所述靶基因探针具有：(I).如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或(II).如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志山，高源，赵梦川，马学军，申辛欣，帖彦清，
申请(专利权)人：冯志山，
类型：发明
国别省市：