优化的慢病毒包装系统技术方案

本发明专利技术提供了优化的慢病毒包装辅助质粒，及包含其的慢病毒包装系统。所述辅助质粒包含密码子优化的HIV

【技术实现步骤摘要】
优化的慢病毒包装系统


[0001]本专利技术属于生物医药领域。更具体地，本专利技术涉及慢病毒包装系统的优化。

技术介绍

[0002]近年来，随着先进治疗方法，例如基因治疗和细胞治疗的飞速发展，病毒载体的使用越来越频繁。其中，由于携带基因片段容量大、转染效率较高、可感染分裂细胞和非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达、安全性较好等优点，慢病毒载体已成为转移目的基因的理想载体。目前常用的慢病毒包装系统包含1个目的质粒和3个辅助质粒(即，四质粒包装系统)，其中辅助质粒的主要作用是指导包装细胞系合成慢病毒基因组mRNA包装成完整病毒颗粒所必需的结构蛋白、聚合酶、包膜蛋白等结构。
[0003]由于辅助质粒对于慢病毒的稳定性、安全性、转染效率等具有重要作用，因此有需要对其进行优化，以提高病毒包装效率。

技术实现思路

[0004]目前常见的四质粒慢病毒包装系统包含三个辅助质粒，例如携带gag、pol基因的pMDLg/RRE质粒，携带rev基因的pRSV-Rev质粒，和携带VSVG基因的pMD2.G质粒，以及一个携带待表达的目标序列的目的质粒。
[0005]Gag基因编码病毒的核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白。pol基因编码病毒复制所必需的酶，例如逆转录酶、内切核酸酶和蛋白合成酶。Rev基因编码调节gag和pol基因表达的调节因子rev基因。VSVG基因编码疱疹病毒的VSVG外壳蛋白，该蛋白允许形成能够靶向多种细胞(尤其是主要组织相容性(MHC)抗原递呈细胞(APC)，包括DC)的混合颗粒(假型)。
[0006]当用辅助质粒和目的质粒同时转染细胞时，辅助质粒提供将目的基因包装到重组病毒载体所需的所有辅助蛋白，因而能在包装细胞系中形成包装好的病毒颗粒并分泌到细胞外的培养基中。从培养基离心回收病毒颗粒后，可以直接用于感染宿主细胞，进而将目的基因引入到宿主细胞中。
[0007]为了提高包装效率和病毒滴度，本专利技术对辅助质粒中的关键基因HIV-1pol、Rev、VSVG的密码子进行了优化。
[0008]因此，本专利技术提供一种密码子优化的HIV-1pol基因，其包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：1所示的序列。
[0009]本专利技术还提供一种密码子优化的Rev基因，其包含与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：2所示的序列。
[0010]本专利技术还提供一种密码子优化的VSVG基因，其包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：3所示的序列。
[0011]本专利技术还提供包含上述密码子优化的HIV-1pol基因、Rev基因或VSVG基因的质粒。优选地，所述质粒是pMDLg/pRRE质粒、pRSV-Rev质粒或pMD2.G质粒。
[0012]本专利技术还提供一种优化的慢病毒包装系统，其包含含有如上所述的密码子优化的HIV-1pol基因、Rev基因和VSVG基因的质粒。优选地，所述慢病毒包装系统包含pMDLg/pRRE质粒、pRSV-Rev质粒和pMD2.G质粒，其中所述pMDLg/pRRE质粒包含如上所述的密码子优化的HIV-1pol基因、pRSV-Rev质粒包含如上所述的密码子优化的Rev基因，pMD2.G质粒包含如上所述的密码子优化的VSVG基因。
[0013]本专利技术还涉及包含如上所述的质粒或慢病毒包装系统的宿主细胞。
[0014]本专利技术还涉及如上所述的慢病毒质粒或包装系统在制备药物或者疫苗中的用途。例如，所述药物是免疫治疗药物，如工程化免疫细胞，优选CAR-T细胞。
[0015]下面将参考附图并结合实例来详细说明本专利技术。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本专利技术的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本专利技术构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
附图说明
[0016]图1示出了优化前的pMDLg/RRE质粒。
[0017]图2示出了优化后的pMDLg/RRE质粒。
[0018]图3示出了优化前的pRSV-Rev质粒。
[0019]图4示出了优化后的pRSV-Rev质粒
[0020]图5示出了优化前的pMD2.G质粒。
[0021]图6示出了优化后的pMD2.G质粒。
具体实施方式
[0022]实施例1.优化的慢病毒包装系统在贴壁细胞培养中的效果验证
[0023]本实施例中采用的目的质粒是pLV-EGFP-RFP(即，表达EGFP-RFP的pLV质粒载体)。
[0024]在6孔板中加入1M 293T细胞和2ml DMEM培养基，于室温下培养过夜。然后更换新鲜的DMEM培养基，并在CO2培养箱中于室温培养1小时。
[0025]按照下表1配制质粒混合溶液，其中优化前的质粒购买自Addgene，优化后的质粒是指经改造以包含本专利技术的密码子优化的HIV-1pol、Rev或VSVG基因的Addgene质粒。向质粒混合溶液加入9ul X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将转染试剂/质粒混合溶液逐滴加入到6孔板中。48小时后，收集包含病毒颗粒的培养上清液，并用流式细胞术检测病毒滴度。结果如表1所示。
[0026]表1.优化的慢病毒包装系统的感染滴度
[0027][0028]从表1的结果可以看出，与未优化的质粒相比，全部采用优化质粒的包装系统将病毒滴度提高了约7倍(0.3vs 2.0)。
[0029]实施例2.优化的慢病毒包装系统在悬浮细胞培养中的效果验证
[0030]按照下表2配制质粒混合溶液，并加入300ul X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche，货号06366236001)和12ml DMEM培养基，混匀后静置15分钟。然后将质粒/转染试剂混合物逐滴加入到125ml震荡培养的293F细胞培养瓶中。
[0031]48小时后，收集包含病毒颗粒的培养上清液，并用流式细胞术检测病毒滴度。结果如表2所示。
[0032]表2.优化的慢病毒包装系统的感染滴度
[0033][0034]从表2的结果可以看出，与未优化的质粒相比，全部采用优化质粒的包装系统将病毒滴度提高了至少2.5倍(1.86vs 4.68)。
[0035]因此，本专利技术提供的包含密码子优化的HIV-1pol、Rev、VSVG基因的慢病毒包装辅助质粒与未经优化的商购质粒相比，能够显著提高病毒滴度。
[0036]需要说明的是，以上仅为本专利技术的优选实施例而已，并不用于限制本专利技术，对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的HIV-1pol基因，其包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：1所示的序列。2.一种密码子优化的Rev基因，其包含与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：2所示的序列。3.一种密码子优化的VSVG基因，其包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的序列，优选包含如SEQ ID NO：3所示的序列。4.一种质粒，其包含权利要求1所述的密码子优化的HIV-1pol基因。5.权利要求4所述的质粒，其是pMDLg/pRRE质粒。6.一种质粒，其包含权利要求2所述的密码子...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明曦，吴长顺，任江涛，贺小宏，王延宾，韩露，
申请(专利权)人：江苏浦珠生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：