一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干方法技术

本发明专利技术公开了一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干方法。将毕赤酵母表达的重组蛋白酶K发酵液澄清过滤后加入稀释液稀释，并经过超滤步骤进行浓缩和透析，获得含微量金属离子和色素的蛋白酶K透析液，将该透析液经过阳离子交换层析分离纯化，获得含重组蛋白酶K的洗脱液；将含重组蛋白酶K的洗脱液放在室温结晶沉淀4

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干的方法。

技术介绍

[0002]蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的提取物纯化获得。主要切割位点为脂族或芳香族等厌水性氨基酸的羧基端的肽键。研究表明，该酶在pH 4～12、20℃～60℃的条件下均有活性，在SDS、尿素、螯合剂(如EDTA)及巯基试剂(如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂)中也具有切割蛋白质的能力。因而它的应用十分广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA、蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。
[0003]蛋白酶K的应用并不仅仅局限在医疗诊断及科研领域，在工业制革、造纸、饲料等领域中也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料。因此，利用基因工程技术和蛋白质工程技术，获得活性高、成本低的蛋白酶K具有较大的社会价值和经济价值。
[0004]目前，工业化生产的基因重组蛋白酶K是以原核细胞(如大肠杆菌)和真核细胞(酵母)为宿主。利用大肠杆菌为宿主其优点是简便、经济。然而，该系统表达得到的蛋白酶K活性不高、产量过低，难以满足市场需求。利用酵母为宿主在重组蛋白酶K的C端添加的六聚组氨酸标签，发酵液需经过离心、金属螯合柱层析和弱阳离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色处理等步骤，工艺步骤较复杂。鉴于蛋白酶K的应用价值，需要开发快速，经济适宜于工业规模化和连续化生产的分离纯化技术。
专利技术内容
[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组蛋白酶K工业化纯化及冻干方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]一种从毕赤酵母中分离纯化重组蛋白酶K的层析方法，依次包括以下步骤：
[0008]1)将毕赤酵母表达的重组蛋白酶K发酵液上清进行澄清处理，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀。采用超滤膜包对稀释后发酵上清进行浓缩，浓缩至终点后，加入等体积透析液进行多次透析，得到含有微量金属离子和色素的蛋白酶K透析液。其中超滤膜包可选择Millipore 5kD、10kD或者Sartorius 5kD、10kD。优选的膜包截留孔径为5kD。
[0009]2)将含有少量金属离子和色素的重组蛋白酶K的透析液，调节pH和电导后经阳离子交换层析，得到含有较高浓度的蛋白酶K洗脱液。其中阳离子交换层析的填料选自NanoGel 30/50SP、UniGel 30/80SP、SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、Bestarose Diomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP、SP Sepharose
TM Fast Flow。在一种实施方式中，阳离子交换层析的填料优选为SP Bestarose FF。阳离子交换层析可选择pH或盐度梯度洗脱，优选氯化钠梯度洗脱。
[0010]3)将得到的蛋白酶K洗脱液，在室温下进行结晶沉淀，在进行结晶沉淀前，优选将所述蛋白酶K洗脱液调节为蛋白浓度在40～50mg/ml范围内。沉淀结束后，采用正压过滤装
置获得蛋白酶K沉淀滤饼。其中过滤纸板为沈阳长城过滤纸板，滤板孔径为0.2～5μm，优选为2.5～5μm。
[0011]4)将得到的蛋白酶K沉淀滤饼加入复溶缓冲液复溶，一种实施方式中，复溶缓冲液为10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0或10～50mM NaAc、0～5mM CaCl2，pH 4.5～5.5。采用优选的冻干配方混匀后，按照优选的冻干工艺进行冻干。将得到的冻干粉进行分包装，最终得到蛋白酶K冻干粉成品。
[0012]其中所述重组蛋白酶K发酵液上清的蛋白酶K活性为30～40U/mgP。
[0013]本专利技术还公开了一种具体实施方式，该实施方式经工艺放大，所得蛋白酶K冻干粉的蛋白纯化收率不小于70％，活性为30～40U/mgP。具体实施步骤为：
[0014]1)毕赤酵母表达的重组蛋白酶K发酵液上清进行澄清处理，测定澄清上清的pH和电导，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀；所述稀释液为：10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0；
[0015]将超滤膜包安装在超滤系统上，控制进口压力和回流压力，调节跨膜压并测定水通量，安装好膜包后进行超滤浓缩；所述超滤膜包截留孔径为5～10kD，所述跨膜压为1～1.25bar或者14.5～18psi或者0.1～0.125MPa。
[0016]将浓缩至终点的浓缩液，加入等体积的透析液进行多次透析，直至透析终点；所述透析液为：10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0；所述透析终点的透出液颜色为无色，电导为0.5～2mS/cm，pH为7.5～9.0。
[0017]2)采用阳离子交换层析介质为博格隆SP Bestarose FF阳离子交换填料，层析步骤为：
[0018]采用5～15倍柱体积的组分为10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0的平衡缓冲液，以50～200cm/小时的流速平衡层析柱；
[0019]以步骤1)的蛋白酶K透析液作为上样样品，以50～200cm/小时的流速上样；其中上样样品电导为0.5～2mS/cm，pH为7.5～9.0，上样载量为56～90mg蛋白/ml填料；
[0020]10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0的平衡缓冲液，以50～200cm/小时的流速对层析柱进行再平衡；
[0021]采用组分为10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，0～100mM NaCl，pH 7.5～9.0的洗脱缓冲液，以50-200cm/小时的流速对层析柱进行洗脱，最终获得蛋白酶K洗脱液；
[0022]所述阳离子层析逐级放大层析的蛋白回收均大于70％。
[0023]3)裁剪大小合适的过滤纸板，装入正压过滤器中，采用组分为10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，0～100mM NaCl，pH 7.5～9.0的洗脱缓冲液润洗正压过滤装置和滤纸板；
[0024]将步骤2)的蛋白酶K洗脱液调节至pH在7.5～9.0，Cond在0～10mS/cm，蛋白浓度在40～50mg/ml范围内，倒入不锈钢桶中，控制环境温度为20～25℃，静置4h以上，直到蛋白酶K结晶沉淀完全；
[0025]将沉淀完全的蛋白酶K分次倒入正压过滤罐中，将压缩空气接入压滤罐，控制压滤罐压力表为0～0.15MPa开始压滤，最终获得蛋白酶K滤饼；
[0026]所述蛋白酶K滤饼中蛋白回收大于90％。
[0027]4)将由步骤3)获得的含重组蛋白酶K的滤饼加入10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0或10～50mM NaAc、0～5mM CaCl2，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白酶K的工业化纯化及冻干方法，依次包括以下步骤：1)将酵母表达的重组蛋白酶K发酵液上清进行澄清处理，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀；采用截留孔径为5～10kD的超滤膜包对稀释后发酵上清进行浓缩，再加入等体积透析液进行多次透析，得到蛋白酶K透析液；2)将所述蛋白酶K透析液，调节pH和电导后经阳离子交换层析，采用pH或盐度梯度洗脱得到高浓度的蛋白酶K洗脱液；其中阳离子交换层析的填料选自NanoGel 30/50SP、UniGel 30/80SP、SP Bestarose FF、SP Bestarose HP、Bestarose Diomond MMC、Uniphere S、MacroPrep S、POROS XS、SP-6FF、SP-6HP或者SP Sepharose
TM Fast Flow；3)将所述蛋白酶K洗脱液，在室温下进行结晶沉淀，沉淀结束后，采用正压过滤装置获得蛋白酶K沉淀滤饼；4)将所述蛋白酶K沉淀滤饼加入复溶缓冲液复溶，进行冻干，最终得到蛋白酶K冻干粉成品；所述方法经过工艺放大，所得蛋白酶K冻干粉的蛋白纯化收率不小于70％，蛋白酶K活性为30～40U/mgP。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白酶K发酵液上清的蛋白酶K活性为30～40U/mgP。3.根据权利要求1所述的方法，其中超滤膜包选自Millipore 5kD、10kD，Sartorius 5kD、10kD。4.根据权利要求1所述的方法，其中阳离子交换层析的填料为SP Bestarose FF。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，在进行结晶沉淀前，将所述蛋白酶K洗脱液调节为蛋白浓度在40～50mg/ml范围内，过滤装置中使用过滤纸板的孔径为2.5～5μm。6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)中复溶缓冲液为10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0或10～50mM NaAc、0～5mM CaCl2，pH 4.5～5.5。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)为：7a)毕赤酵母表达的重组蛋白酶K发酵液上清进行澄清处理，测定澄清上清的pH和电导，然后加入等体积的稀释液稀释后混匀；所述稀释液为：10～50mM Tris、0～5mM CaCl2，pH 7.5～9.0；7b)将超滤膜包安装在超滤系统上，控制进口压力和回流压力，调节跨膜压并测定水通量，安装好膜包后进行超滤浓缩；所述超滤膜包截留孔径为5～10kD，所述跨膜压为1～1.25bar或者14.5～18psi或者0.1～0.125MPa。7c)将浓缩至终点的浓缩液，加入等体积的透析液进行多次透析，直至透析终点；所述透析液为：...

【专利技术属性】
技术研发人员：占全，杨代常，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：