桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法技术

本发明专利技术公布了一种桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法，用于桑花叶型矮缩相关双生病毒的特异性检测。该检测引物组是根据桑花叶型矮缩相关双生病毒编码的V2基因序列设计，V2基因序列如Seq ID NO：1所示，包括以下三组引物：FIP、BIP、F3、B3、LF、LB，序列分别为SEQ ID NO：2～7所示。通过DNA提取、LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳后可产生阶梯状条带。本发明专利技术针对桑花叶型矮缩相关双生病毒建立的可视化检测方法具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，为桑花叶型矮缩相关双生病毒防治提供技术依据。治提供技术依据。治提供技术依据。

【技术实现步骤摘要】
桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种单链DNA病毒，双生病毒科，桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf
‑
associated virus,MMDaV)的LAMP检测引物组及其可视化检测方法。

技术介绍

[0002]桑花叶型矮缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf
‑
associated virus,MMDaV)是严重影响桑树的生长和桑叶产量的一种单组份双生病毒，该病害发生时，桑树呈现矮化、叶片黄化皱缩、等症状。MMDaV的基因组是大小为2952nt的单链环状DNA分子，病毒链含有5个ORF(V1、V2、V3、V4和V5)：V1可能编码衣壳蛋白，V2编码的蛋白为RNA沉默抑制子，V3、V4和V5的序列与已知的双生病毒序列的同源性很低，其编码的蛋白的功能还不明确；互补链含有2个ORF(C1和C1：C2)，其编码的蛋白可诱导细胞死亡，也可能参与病毒的复制。MMDaV的病毒链与互补链之间为基因间隔区，含有病毒复制和转录的起始位点。
[0003]目前，主要利用聚合酶链式反应(PCR)检测MMDaV，但PCR需要昂贵的仪器和训练有素的科研人员，费时费力。
[0004]因此，开发一种新的灵敏、快速、准确、便捷的诊断技术快速鉴定MMDaV对桑叶生产和桑蚕产业的发展都具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供桑花叶型矮缩相关双生病毒(Mulberry mosaic dwarf
‑
associated virus,MMDaV)的LAMP检测引物组。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP可视化检测方法及其应用。环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，可在65℃等温条件下进行扩增，特异性高，灵敏度强，操作简便。本专利技术根据MMDaV的V2蛋白的基因序列设计了LAMP引物并建立了检测方法，可对该病毒实施准确、灵敏、快速的检测。这对于提高桑树生产和潜在的防治措施(如无毒苗的培育)的制定具有重要意义。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0008]桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组，基于MMDaV V2基因序列，用LAMP引物设计软件primer explorer(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计引物，得到三组引物：
[0009]FIP：5'
‑
GACTCGAACAGTCCTGGGCCT
‑
CTGAGATCAAGGCGGGGA
‑
3'
[0010]BIP：5'
‑
GTTGCAAGTGCCATGCGAACC
‑
GGCCGTCTCTTCCTTCTTG
‑
3'
[0011]F3：5'
‑
TGATTACCAGGAGCTCTGCT
‑
3'
[0012]B3：5'
‑
GTTTCACTGGGCCCAACG
‑
3'
[0013]LF：5'
‑
CCGTGGAATGGTTCCTGGATTC
‑
3'
[0014]LB：5'
‑
CGTGGAGAAGAAGAGGCCCAAG
‑
3'
[0015]序列分别如SEQ ID NO：2
‑
7所示。所述的V2基因序列如SEQ ID NO：1所示。
[0016]基于上述LAMP检测引物组的桑花叶型矮缩相关双生病毒的可视化检测方法，主要包括以下步骤：
[0017](1)植物总DNA的提取：采用CTAB方法从采集的感染桑花叶型矮缩相关双生病毒的桑树中提取植物基因组总DNA；
[0018](2)LAMP反应：以该植物基因组总DNA为模板，采用LAMP检测引物组进行LAMP反应；
[0019](3)LAMP产物显色反应：在LAMP产物中加入SYBR Green I染料，拍照记录,有绿色荧光的判断为阳性，显示黄棕色的为阴性；
[0020](4)LAMP产物琼脂糖凝胶电泳：取5μL显色过的样品，用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，有阶梯状条带的判断为阳性，无条带的为阴性。
[0021]本专利技术所述的LAMP可视化检测方法可用于桑花叶型矮缩相关双生病毒的特异性分析。
[0022]本专利技术所述的LAMP可视化检测方法可用于桑花叶型矮缩相关双生病毒的灵敏度分析。
[0023]本专利技术所述的LAMP可视化检测方法可用于桑花叶型矮缩相关双生病毒防治。
[0024]同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：
[0025](1)结果可靠：本专利技术所设计出的LAMP检测引物，已经对桑花叶型矮缩相关双生病毒进行了测试验证，因此对结果可靠性具有充分的保证。
[0026](2)特异性强：本专利技术所采用的LAMP引物是针对MMDaV V2基因序列设计出6条特异性引物，扩增中国番茄黄曲叶病毒(TYLCCNV/TYLCCNB)、番茄黄曲叶病毒(TYLCV)、云南番茄曲叶病毒(TLCYnV)、番茄金色花叶病毒(TGMV)、甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)阳性样品，均没有扩增出特异条带，因此可以认为该方法特异性较强。
[0027](3)灵敏度高：LAMP对桑花叶型矮缩相关双生病毒的检测灵敏度在DNA水平上可达到0.2ng，具有较高的灵敏度。
[0028](4)操作简便：本专利技术在等温条件下进行，只需一个恒温设备即可，不需要昂贵的仪器设备和试剂。
[0029](5)快速直观：对桑花叶型矮缩相关双生病毒进行检测可在1小时内完成，恒温扩增过程中加入了SYBR Green I染料，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，实现了可视化的检测方法。本专利技术针对桑花叶型矮缩相关双生病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层检测中有很好的应用前景。
[0030]下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组及其可视化检测方法作进一步说明。
附图说明
[0031]图1为MMDaV的LAMP引物的位置图。
[0032]图2为MMDaV的LAMP检测结果图。A：LAMP产物琼脂糖凝胶电泳图；B：LAMP产物显示
图(SYBR Green I染色后白光下拍摄)；
[0033]其中，M：DNA Marker；1：MMDaV病毒样品，2：健康植株对照，3：水。
[0034]图3为MM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桑花叶型矮缩相关双生病毒的LAMP检测引物组，其特征在于：为基于MMDaV V2基因序列设计的三组引物，其中，V2基因序列如Seq ID NO：1所示；引物组如下所示：FIP：5'
‑
GACTCGAACAGTCCTGGGCCT
‑
CTGAGATCAAGGCGGGGA
‑
3'BIP：5'
‑
GTTGCAAGTGCCATGCGAACC
‑
GGCCGTCTCTTCCTTCTTG
‑
3'F3：5'
‑
TGATTACCAGGAGCTCTGCT
‑
3'B3：5'
‑
GTTTCACTGGGCCCAACG
‑
3'LF：5'
‑
CCGTGGAATGGTTCCTGGATTC
‑
3'LB：5'
‑
CGTGGAGAAGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀玲，周雪平，孙少双，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：