一种生产琥珀酸的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种生产琥珀酸的方法，其包括如下步骤：将解脂酵母菌种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为24

【技术实现步骤摘要】
一种生产琥珀酸的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产琥珀酸的方法。

技术介绍

[0002]琥珀酸(Succinic acid)，学名丁二酸，是一种安全的天然有机物和重要的有机合成中间体。琥珀酸作为前体物可用于生产许多高附加值衍生物，广泛应用于食品、制药、离子螯合剂、去污剂、表面活性剂的生产领域。琥珀酸近年来逐渐攀升为大宗化学品，全球琥珀酸的年产量为3万～5万吨。传统琥珀酸的生产主要是通过丁烷制备顺式丁烯二酸酐再经化学方法加工而成，需要重金属Pd和Ru的催化。随着石油资源的减少和环境污染问题的加重，石油基的化工生产向生物化工生产琥珀酸的转换很有必要，而以可再生资源为原料的高效环保的琥珀酸发酵法具有重大的应用潜力。
[0003]与石油基的传统化工炼制琥珀酸相比，生物发酵法生产琥珀酸须大幅降低生产成本。除发酵效率外，发酵下游的后提取纯化过程是影响琥珀酸生产成本的最重要因素。细菌的菌体培养和发酵环境接近中性，发酵过程需不断流加碱液维持 pH值的稳定。因此，生成的琥珀酸盐需要酸化处理转变为游离的琥珀酸，该阶段成本大概占生产成本的60％～70％。酵母能耐受低pH值，可以在低pH值下进行生物发酵，直接把底物转化为琥珀酸而不是琥珀酸盐。发酵完成后，去除菌体后的发酵液直接蒸发结晶，产物下游处理步骤少，能够大幅度节约生产成本。此外，酵母的细胞生长比细菌更具有优势，能达到更高的生物量，并且性能优良稳定。
[0004]琥珀酸是微生物中心代谢途径三羧酸循环(TCA)的中间代谢产物之一，并且还是多种兼性厌氧菌和严格厌氧菌的代谢末端产物，可以通过微生物利用可再生的碳水化合物资源进行生产。随着生物技术和微生物分子遗传学的发展，代谢工程作为一种强有力的工具已经成功运用于高产琥珀酸的基因工程菌的开发中。
[0005]用于生产琥珀酸的细菌包括琥珀酸天然产生菌和代谢工程重组菌两大类。天然生产琥珀酸的菌株多是从瘤胃中分离出来的，例如产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、曼海姆产琥珀酸菌等。它们皆是兼性厌氧或者严格厌氧的革兰阴性菌，嗜温、嗜CO2，利用TCA还原支路生产琥珀酸。产琥珀酸放线杆菌是一种性能较好的易得菌种，可利用多种碳源发酵，并且能耐受高浓度的琥珀酸和葡萄糖，其对葡萄糖和琥珀酸的耐受性可以高达158g/L和104g/L。产琥珀酸厌氧螺菌可自然产生较高浓度的琥珀酸，但对高浓度葡萄糖和琥珀酸盐的耐受性较差，而且要求严格厌氧环境，营养条件复杂，生产成本较高。曼海姆产琥珀酸菌也可以利用多种碳源生产琥珀酸，有完整的TCA循环，能够有氧生长，但它的琥珀酸生产能力弱于上述两种天然宿主菌。
[0006]在自然界中，这些天然生产琥珀酸的微生物存在于氨基酸和维生素丰富的地方，它们多是营养缺陷型菌株，许多还是条件致病菌，菌株的生长差、需要营养丰富的昂贵培养基。此外，这些琥珀酸生产菌的遗传信息和研究工具不够成熟。为解决这些问题，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等遗传背景研究清楚、非天然生产琥珀酸的细菌被广泛用于代谢工程改造生
产琥珀酸的研究。
[0007]大肠杆菌属于兼性厌氧菌。有氧条件下生产琥珀酸需要失活琥珀酸脱氢酶 (SDH)，阻断TCA循环的中间代谢物琥珀酸向下游转化，也可以通过打开乙醛酸支路来积累琥珀酸。厌氧条件下的琥珀酸发酵是通过TCA还原支路和部分乙醛酸支路进行。另外，大肠杆菌在发酵过程中会有乙酸溢出，需要通过代谢工程手段阻断主要的乙酸产生途径。除了大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌也是一种生长良好、安全、易于控制的生产宿主，它可以进行有氧
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厌氧双阶段发酵。由此可见，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等工程细菌作为琥珀酸生产菌株，琥珀酸的产量、得率方面都达到较高的水平。但是，由于细菌不耐受酸性环境，细胞生长和发酵过程需要持续流加碱液来维持pH值中性，导致在发酵后提取阶段，生成的琥珀酸盐需要酸化处理转变为游离的琥珀酸再进行结晶提取。
[0008]在酵母中生产琥珀酸最初是为了改善酿酒酵母所产酒的风味，研究主要集中在TCA循环中的琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶等。通过敲除琥珀酸脱氢酶的编码基因来阻断线粒体的TCA循环可以实现琥珀酸积累；而同时敲除琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的相应编码基因可以利用氧化的TCA循环和乙醛酸途径共同积累琥珀酸。鉴于TCA还原支路生产琥珀酸的理论得率是TCA氧化支路的二倍，中科院过程工程研究所邢建民实验室在敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶、甘油
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磷酸脱氢酶及延胡索酸酶基因的基础上，在细胞质内表达TCA还原支路各步反应的酶(丙酮酸羧化酶PYC2p，苹果酸脱氢酶MDH3p，大肠杆菌来源的延胡索酸酶 EcFumCp和延胡索酸还原酶FRDS1p)。在低pH值(控制pH在3.8)并通入足量的CO2时，重组菌在3L发酵罐中发酵120h可得到12.97g/L琥珀酸，得率为 0.21mol/mol葡萄糖。虽然酿酒酵母能耐受低pH值等环境压力，但是较低的产量和产率限制了酿酒酵母作为细胞工厂用于琥珀酸生产的开发研究。
[0009]除酿酒酵母外，解脂耶氏酵母是近年来另一被广泛研究的酵母菌种。它属于非传统酵母，严格好氧，具有二态性，利用完整的TCA循环和电子传递链维持生长。解脂酵母具有很多特殊的生理、代谢以及基因方面的特性。它可利用的底物范围非常广泛，包括葡萄糖、甘油、乙醇、脂肪酸、油脂和正烷烃等。它能在 pH值为3.0～7.5的范围内生长，在pH值低于3.0时仍能进行发酵。通过自然筛选或进一步代谢工程改造，解脂酵母能积累大量有机酸，如柠檬酸、异柠檬酸和α
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酮戊二酸等，因此解脂酵母逐渐发展成为一种重要的工业菌株。
[0010]Yovkova等人通过代谢工程精细调控产α
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酮戊二酸的解脂酵母细胞的代谢流、减少副产物丙酮酸的积累。近期，文献报道通过突变解脂酵母的琥珀酸脱氢酶编码基因或替换其启动子，皆可获得能积累琥珀酸的重组菌。Yuzbashev等人通过基因敲除的策略构建缺失琥珀酸脱氢酶活性的解脂酵母重组菌，然后利用 N
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甲基
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N'
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硝基
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N
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亚硝基胍进行化学诱变和筛选，得到的突变株在完全培养基中发酵7天可产生17g/L琥珀酸。随后，该课题组采用定向进化的方法获得了菌体生长和琥珀酸的生物合成都得到强化的突变株，在发酵罐中通过补料
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分批发酵36h即可合成40.5g/L琥珀酸。该发酵过程无需控制pH值，驯化突变株的产率和得率都得到大幅提高。以上研究初步展现了解脂酵母作为细胞工厂生产琥珀酸的潜力。
[0011]但仍有一些问题亟需解决，重组菌Y.lipolytica在琥珀酸发酵时产生较多的副产物乙酸，影响细胞的生长，菌体的生物量偏低，发酵周期长。乙酸在细胞内中性环境可以部分解离成CH3COO
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和H
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，降低了膜内的pH值，使膜内外的pH 差减小，减弱了质子推动力，导致
推动ADP磷酸化生成ATP的能量不足，扰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产琥珀酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）将解脂酵母菌种子液接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵时间为24
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48h，然后接入莱茵衣藻，同时添加营养液，继续发酵培养36h，停止发酵，将发酵罐与陶瓷膜偶联，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，得到滤液和微生物；步骤2）将步骤1）所得滤液离心，收集上清液，然后经过H
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型强酸性阳离子交换树脂，收集通过液，减压蒸发，浓缩至原体积的三分之一，然后将浓缩液冷却至8℃，静置24h，使琥珀酸结晶析出，分离晶体和母液，收集晶体，最后干燥，得到琥珀酸产品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）将解脂酵母菌种子液按照6
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8%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度28
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29℃，转速为400
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500rpm，通气量为0.5
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0.6vvm，发酵时间为24
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48h，然后按照6
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8%的接种量接入莱茵衣藻，同时添加占发酵液5
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10%体积的营养液，继续发酵培养36h，停止发酵，将发酵罐与陶瓷膜偶联，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离，得到滤液和微生物，微生物用于制备饲用蛋白；整个发酵过程中，通过流加泡敌消泡；步骤2）将步骤1）所得滤液置于离心机中，5000...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建阳，来凤堂，薄文文，袁军，郑世涛，郝武斌，刘晶晶，
申请(专利权)人：山东阜丰发酵有限公司，
类型：发明
国别省市：