壳聚糖-核酸纳米颗粒的可逆包衣以及其使用方法技术

本文描述了含有可逆结合的聚合物包衣的壳聚糖

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】壳聚糖
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核酸纳米颗粒的可逆包衣以及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年3月14日提交的美国临时申请No.62/818,425、2019年10月18日提交的美国临时申请No.62/923,403和2019年10月21日提交的美国临时申请No.62/924,131的优先权，这些临时申请的内容以引用的方式整体并入本文中并用于达成所有目的。

技术介绍

[0003]壳聚糖是几丁质的脱乙酰形式。壳聚糖是N
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乙酰基
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D
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葡萄糖胺与D
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葡萄糖胺的无毒阳离子聚合物。壳聚糖可以与核酸形成复合物，并且作为一种生物相容性无毒多糖，已被用作DNA递送媒介物来转染细胞。由于病毒载体的复杂性和潜在毒性，所以很大兴趣集中在使用壳聚糖进行核酸的非病毒递送。
[0004]已经检查了多种壳聚糖/DNA复合物，包括修饰的壳聚糖与核酸之间的复合物，以试图鉴定非常适合基因转染的组合物。参见例如WO 2010/088565；WO 2008/082282。已经发现这些复合物在重要的物理化学和生物学特性方面存在差异，其中包括溶解性、聚集倾向、复合物稳定性、粒径、释放DNA的能力和转染效率。
[0005]已经通过用精氨酸和亲水性多元醇对壳聚糖主链进行官能化开发了转染效率得到提高的壳聚糖
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核酸多聚复合物。参见例如美国专利No.10,046,066和9,623,112。具体地说，这些多聚复合物在肠道微环境中表现出显著的稳定性，与体循环相比，由于显著的pH值变化、酶活性和复杂的粘膜相互作用，因此带来了独特的挑战。
[0006]由于粘蛋白纤维的致密网络可以通过粘合和空间相互作用有效地捕获外来微粒，然后快速清除，因此粘膜屏障对纳米颗粒递送系统来说是一个独特的挑战。实际上，特别是对于口服药物递送，肠粘膜可以在短短五十(50)分钟内翻转，导致非常有效地清除所施用的颗粒。参见例如Lehr等人,Int
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l J.Pharm.70:235
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40(1991)。粘蛋白纤维含有对带正电荷的颗粒具有高亲和力的高度糖基化的区段，以及可以在高亲合力下结合疏水性材料，包括如聚(乳酸
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共
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乙醇酸)(PLGA)的许多常用药物递送材料的周期性疏水性结构域。这些复杂的电荷相互作用加上空间位阻已证明是纳米颗粒药物递送形式在没有某种形式的屏蔽的情况下难以克服的。然而，相反，传统的屏蔽方法通常会产生转染能力大大降低的纳米颗粒。
[0007]聚乙二醇(PEG)已经成为各种屏蔽策略的主要成分，这至少最初是基于已证明其能够通过互穿网络效应增加粘膜粘附，从而延长药物递送。参见例如Huckaby和Lai,Advanced Drug Delivery Reviews 124:125
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39(2018)。然而，不幸的是，这些粘膜粘附策略不适用于需要细胞内递送的治疗剂，例如核酸，因为增强的粘膜粘附会阻止颗粒到达下面的上皮或其它相关的目标组织。矛盾的是，也许PEG包衣也已用于试图增强颗粒扩散的粘液惰性方法。然而，值得注意的是，最近对这些类型系统的发现和结论强调了高PEG接枝密度对最大限度地减少粘蛋白亲和力和增强粘膜渗透的重要性。同前,Wang和Lai,Angew Chem 47:9726
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9729(2008)。这些异常密集和共价结合的聚乙二醇化策略对于有效的基因转染来说是有问题的。
[0008]因此，仍然需要具有改进的粘膜渗透特性的用于体内基因转移的新组合物和方法。

技术实现思路

[0009]本文提供了用于减少壳聚糖
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核酸纳米颗粒的粘膜粘附和增强粘膜渗透的组合物和方法，其采用可逆(即非共价结合)聚合物包衣，所述聚合物包衣包含多种线性嵌段共聚物，所述线性嵌段共聚物具有带负电荷的锚定区和至少一个(例如亲水性)不带电的尾区。在优选的实施方案中，线性嵌段共聚物是包含至少一个聚阴离子锚定区和至少一个PEG尾区的二嵌段或三嵌段共聚物。在一些实施方案中，在比先前所预期低的表面包衣密度下本文所述的组合物意外地减少粘膜粘附并且增强粘膜渗透。在一些实施方案中，尽管存在聚阴离子，本文所述的组合物却意外地提供一致的物理和/或化学稳定性。在一些实施方案中，尽管包括可逆聚合物包衣，本文所述的组合物却意外地提供一致和/或可比较的转染效率。在一些实施方案中，本文所述的组合物在散装和/或呈包衣或囊封形式长期(例如数月)存储期间意外地稳定。在一些实施方案中，当与粘膜屏障和/或粘液相关流体(例如尿或胃液或小肠液)接触时，本文所述的组合物意外地稳定。
[0010]在一方面，本专利技术提供了壳聚糖组合物，所述壳聚糖组合物包含与多种含聚阴离子的嵌段共聚物(例如线性二嵌段和/或三嵌段共聚物)形成复合物的壳聚糖衍生物核酸纳米颗粒(多聚复合物)，每种共聚物包含至少一个聚阴离子锚定区和至少一个亲水性(例如不带电)尾区。典型地，多聚复合物形成核心并且聚阴离子
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亲水性聚合物形成例如至少部分的外部包衣。多聚复合物与含聚阴离子的嵌段共聚物之间的复合物典型地借助于聚合物的聚阴离子锚定区与未包衣的多聚复合物的净正电荷之间的可逆和非共价的静电相互作用形成。在一些情况下，复合物是可逆的，因为通过增加离子强度以降低多聚复合物与聚合物的聚阴离子锚定区之间的静电相互作用的强度，和/或降低pH值以将聚合物的聚阴离子区中的阴离子部分质子化，可以从复合物释放聚阴离子
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亲水性聚合物全部或一部分。
[0011]可用于本专利技术的方法和组合物的示例性二嵌段共聚物分子是包含聚乙二醇(PEG)尾区和聚阴离子(PA)锚定区的“PEG
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PA”共聚物分子。可用于本专利技术的方法和组合物的示例性三嵌段共聚物分子是包含两侧是两个PEG尾区的中央PA锚定区[PEG
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PA
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PEG]，或两个PA锚定区在中央PEG尾区两侧[PA
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PEG
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PA]的“PEG
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PA”共聚物分子。
[0012]在一些实施方案中，本专利技术提供了一种包含壳聚糖衍生物纳米颗粒和至少一种核酸分子的复合物，所述壳聚糖衍生物纳米颗粒包含氨基官能化的壳聚糖，其中所述至少一种核酸分子以大于3:1的氨基与磷(N:P)摩尔比率非共价结合于所述壳聚糖衍生物纳米颗粒，从而形成具有正电荷的衍生化壳聚糖核酸复合物；和非共价结合于壳聚糖衍生物纳米颗粒的多种线性嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物包含至少一个聚阴离子(PA)锚定区和至少一个聚乙二醇(PEG)尾区，并且其中所述组合物包含大于约1:100且小于约10:1的氨基与阴离子(N:A)摩尔比率。
[0013]在一些实施方案中，线性嵌段共聚物是包含PA锚定区和PEG尾区的二嵌段共聚物。在一些实施方案中，线性嵌段共聚物是三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物包含两侧是两个PEG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，所述组合物包含：(a)包含壳聚糖衍生物纳米颗粒和至少一种核酸分子的复合物，所述壳聚糖衍生物纳米颗粒包含氨基官能化的壳聚糖，其中所述至少一种核酸分子以大于3:1的氨基与磷(N:P)摩尔比率非共价结合于所述壳聚糖衍生物纳米颗粒，从而形成具有正电荷的衍生化壳聚糖核酸复合物；和(b)非共价结合于所述壳聚糖衍生物纳米颗粒的多种线性嵌段共聚物，其中所述线性嵌段共聚物包含至少一个聚阴离子(PA)锚定区和至少一个聚乙二醇(PEG)尾区，其中所述PEG
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PA分子非共价结合于所述壳聚糖衍生物纳米颗粒，并且其中所述组合物包含大于约1:100且小于约10:1的氨基与阴离子(N:A)摩尔比率。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述线性嵌段共聚物是包含PA锚定区和PEG尾区的二嵌段共聚物。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述线性嵌段共聚物是三嵌段共聚物，所述三嵌段共聚物包含两侧是两个PEG尾区的中央PA锚定区，或可替代地，两侧是两个PA锚定区的中央PEG尾区。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PA尾区包含多肽，其中所述多肽带负电荷。5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PA尾区包含碳水化合物，其中所述碳水化合物带负电荷。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述碳水化合物包含多个羧酸酯、磷酸酯和/或硫酸酯部分。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述碳水化合物是糖胺聚糖。8.根据权利要求1所述的组合物，其中PEG
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PA分子包含：(a)PEG
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聚谷氨酸(PEG
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PGA)分子；(b)PEG
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聚天冬氨酸(PEG
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PAA)分子；或(c)PEG
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透明质酸(PEG
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HA)分子，或(a)
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(c)中的1项、或2项或所有项的组合。9.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述PEG
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PA分子的PEG部分包含约500Da至约50,000Da、优选约1,000Da至约10,000Da、更优选约1,500Da至约7,500Da、更优选约3,000Da至约5,000Da、最优选约5,000Da的重量平均分子量(Mw)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述PEG
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PA分子的PA部分包含约500Da至约3,000Da、更优选约1,000Da至约2,500Da、更优选约1,500Da的重量平均分子量(Mw)。11.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述PEG
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PA分子的PA部分包含例如包含约5至约25个酸性氨基酸的线性多肽。12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述N:P摩尔比率大于约3:1且小于约100:1，更优选大于约5:1且小于约50:1，更优选大于约5:1且小于约30:1，更优选大于约5:1且小于约20:1，更优选大于约5:1且小于约10:1，最优选为约7:1。13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述N:A摩尔比率大于约1:75且小于约8:1，更优选大于约1:50且小于约6:1，更优选大于约1:25且小于约6:1，更优选大于约1:10且小于约6:1，更优选大于约1:5且小于约6:1。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述N:P摩尔比率为约1:8至约30:1(例如至约20:1、15:1、10:1、8:1或7:1)，并且其中所述P:A摩尔比率为约1:50至约1:5，更优选地，其中所述N:A摩尔比率为约1:10至约5，更优选约1:5至约2，更优选约1:3至约1.5，更优选约1:2.5至约1，更优选地，其中N:P:A比率为约7:1:7、约7:1:12或约7:1:17。15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述壳聚糖衍生物纳米颗粒包含式II的多元醇或经式II的多元醇官能化：其中(a)R2选自：H和羟基；(b)R3选自：H和羟基；并且(c)X选自任选地经一个或多个羟基取代基取代的C2‑
C6亚烷基。16.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述壳聚糖衍生物纳米颗粒包含式III的多元醇：式III的多元醇：其中：
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【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：恩根尼公司，
类型：发明
国别省市：