一种封闭式的菌体裂解工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种封闭式的菌体裂解工艺。具体地，本发明专利技术提供一种菌体裂解方法，所述的方法包括步骤：(1)将菌体液置于第一摇床中进行摇动后，将裂解液加入到摇动的菌体液中，经摇动混匀后，静置，得到初菌体裂解液，其中，所述的第一摇床的转速为10

【技术实现步骤摘要】
一种封闭式的菌体裂解工艺


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种封闭式的菌体裂解工艺。

技术介绍

[0002]基因治疗(gene therapy)是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，或通过外源基因表达的产物作用于疾病靶点，以达到治疗目的。
[0003]质粒载体是基因治疗的基础，可以直接用于体内治疗，也可以被包装成病毒载体，或者在体外修饰靶细胞(如T细胞或者干细胞)后用于患者的治疗。
[0004]质粒载体的纯度(包括超螺旋比例和内毒含量等)会影响到下游病毒的包装和基因治疗的疗效。质粒可以分为开环、超螺旋、复制中间体等。开环会导致功能基因的失活，让病毒包装效能或者体内疗效下降，因此超螺旋比例是质粒的关键质量属性，也是质粒纯化过程中的关键控制点。虽然说纯化工艺可以去除一部分开环，但是如何控制开环的形成才是质粒生产的关键要素。
[0005]工程化质粒使用大肠杆菌发酵生产，碱裂解法是从大肠杆菌中提取质粒的常用方法，开环大多是在菌体裂解过程中产生的。传统工艺采用手工裂解或者搅拌裂解的方法，前一种方法的产能因操作者而异；不容易控制，而且通量较小；后一种方法剪切力太大，对质粒的损伤较大，特别是大质粒，很容易导致开环的形成。
[0006]因此，本领域需要开发一种简单、方便且高质量提取质粒的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种菌体裂解方法，所述的菌体裂解方法能够显著提高菌体与裂解液充分混合，从而使质粒从菌体中释放出来，提高质粒的产量和重量。
[0008]本专利技术第一方面，提供一种菌体裂解方法，所述的方法包括步骤：
[0009](1)将菌体液置于第一摇床中进行摇动后，将裂解液加入到摇动的菌体液中，经摇动混匀后，静置，得到初菌体裂解液，其中，所述的第一摇床的转速为10-30rpm，所述的混匀时间为1-10min；
[0010](2)将初菌体裂解液置于第二摇床中进行摇动后，将缓冲液加入到摇动的初菌体裂解液中，经摇动混匀后，静置，得到菌体裂解液；其中，所述的第二摇床的转速为10-70rpm，所述的混匀时间为1-10min。
[0011]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的菌体为经质粒改造的工程菌菌体。
[0012]在另一优选例中，所述的质粒包括P1质粒。
[0013]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的菌体包括Top10大肠杆菌工程菌。
[0014]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的第一摇床的转速为10-20rpm。
[0015]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的静置时间为1-60min，较佳地 1-8min，更佳地1-5min。
[0016]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的混匀时间为1-8min，较佳地 3-8min。
[0017]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的菌体液包括菌体缓冲液。
[0018]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的菌体液通过以下方法制备：
[0019](1-1)将菌体与缓冲液混合后，在第三摇床上进行摇动混匀后，得到菌体液。
[0020]在另一优选例中，所述的步骤(1-1)中，所述的缓冲液包括Tris缓冲液。
[0021]在另一优选例中，所述的步骤(1-1)中，所述第三摇床的转速为10-70rpm，较佳地10-20rpm。
[0022]在另一优选例中，所述的步骤(1-1)中，所述混匀的时间为1-5min。
[0023]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，将所述的裂解液以50ml-400ml/min，较佳地50-300ml/min，更佳地50-200ml/min，更佳地150-200ml/min的流速加入到摇动的菌体液中。
[0024]在另一优选例中，所述的第一摇床、第二摇床和第二摇床为同一摇床或不同摇床。
[0025]在另一优选例中，所述的第一摇床为3D或者2D摇床；和/或所述的第二摇床为3D或者2D摇床。
[0026]在另一优选例中，所述的第三摇床为3D或者2D摇床。
[0027]在另一优选例中，所述的第一摇床为前后摇摆、左右摇摆和/或波浪式摇床。
[0028]在另一优选例中，所述的第二摇床为前后摇摆、左右摇摆和/或波浪式摇床。
[0029]在另一优选例中，所述的第三摇床为前后摇摆、左右摇摆和/或波浪式摇床。
[0030]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的裂解液包括NaOH/SDS裂解液。
[0031]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的裂解液包括NaOH/SDS组分。
[0032]在另一优选例中，所述的第一摇床包括第一托盘。
[0033]在另一优选例中，所述的第二摇床包括第二托盘。
[0034]在另一优选例中，所述的第三摇床包括第三托盘。
[0035]在另一优选例中，所述的步骤(1)中，所述的菌体液置于所述的第一托盘上进行摇动，所述的第一托盘与与水平面的角度为10-20。
[0036]在另一优选例中，所述的菌体液置于配液袋中。
[0037]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的初菌体裂解液置于所述的第二托盘上进行摇动，所述的第二托盘与与水平面的角度为10-20
°
。
[0038]在另一优选例中，所述的初菌体裂解液置于配液袋中。
[0039]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的静置时间为1-60min。
[0040]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的缓冲液包括醋酸盐(如醋酸钾)缓冲液。
[0041]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，将缓冲液以50ml-400ml/min，较佳地50ml-300ml/min，较佳地50-200ml/min，更佳地150-200ml/min的流速加入到摇动的初菌体裂解液中。
[0042]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的第二摇床的转速为30-55rpm，较佳地40-50rpm。
[0043]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的混匀时间为3-8min
[0044]在另一优选例中，所述的步骤(2)中，所述的静置时间为1-60min，较佳地 3-8min。
[0045]本专利技术第二方面，提供一种制备质粒的方法，所述的方法包括步骤：
[0046](a)用如本专利技术第一方面所述的菌体裂解方法对经质粒改造的工程菌菌体进行裂解，得到菌体裂解液；
[0047](b)从所述菌体裂解液中分离得到质粒。
[0048]应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0049][0050]图1为裂解产物DNA凝胶电泳结果图。
[0051]图2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌体裂解方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(1)将菌体液置于第一摇床中进行摇动后，将裂解液加入到摇动的菌体液中，经摇动混匀后，静置，得到初菌体裂解液，其中，所述的第一摇床的转速为10-30rpm，所述的混匀时间为1-10min；(2)将初菌体裂解液置于第二摇床中进行摇动后，将缓冲液加入到摇动的初菌体裂解液中，经摇动混匀后，静置，得到菌体裂解液；其中，所述的第二摇床的转速为10-70rpm，所述的混匀时间为1-10min。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的第一摇床的转速为10-20rpm。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的混匀时间为1-8min，较佳地3-8min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一摇床为3D或者2D摇床；和/或所述的第二摇床为3D或者2D摇床。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一摇床为前后摇摆、左右摇摆和/或波浪式摇床。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维迪，傅纪星，常依娜，洪谊，张丽，
申请(专利权)人：西比曼生物科技香港有限公司，
类型：发明
国别省市：