TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用制造技术

本发明专利技术提供了TDGF1在人多能干细胞(hPSC)来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供的TDGF1在由人多能干细胞分化的细胞或原代细胞中几乎不表达，可以针对由人多能干细胞分化获得内胚层、中胚层和外胚层的分化细胞产品进行检测，不需要更换标记基因；并且具有检测精确、稳定的特点，并且TDGF1的检测灵敏度高达0.001％，同时相对于培养法大大缩短了检测时间，大大提高了检测效率。高了检测效率。高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。

技术介绍

[0002]人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)，包括人胚干细胞(human embryonic stem cell，hESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)，是一类能在体外无限增殖，且具有分化为成体几乎所有功能细胞潜能的干细胞。基于这两个特性，hPSC在针对目前尚无有效疗法的疑难杂症的治疗上有着广阔的临床应用前景。目前，随着干细胞技术的快速发展，越来越多的hPSC来源功能细胞产品已在各国获批进入临床试验，包括神经细胞、心肌细胞、视网膜色素上皮细胞、自然杀伤细胞、间充质类细胞等。另一方面，hPSC来源功能细胞的临床应用，相比于成体来源的细胞产品，面临着更大的安全性风险，尤其是成瘤性风险。hPSC来源的功能细胞的成瘤性风险主要来自以下3个方面：1)细胞产品中hPSC的残留，而hPSC在体内能形成畸胎瘤；2)hPSC的培养、诱导分化过程中积累的基因突变可能引起癌变或病变；3)hPSC诱导分化的功能细胞产品中可能存在具有很强增殖能力的前体细胞，或产品本身就是前体细胞，如神经干细胞，后者在移植入体内后，可能会大量扩增，形成肿瘤。因此，需要建立高灵敏度的方法检测hPSC来源功能细胞产品中的hPSC残留，以确保功能细胞产品中不含hPSC，增加移植的安全性。
[0003]目前，hPSC残留检测的方法有以下几种：1)免疫荧光染色法，即将待检细胞按一定密度接种于基质胶包被的细胞培养板中，用hPSC特异性免疫荧光抗体对残留的hPSC进行染色，但是该方法灵敏度极低，同时对细胞铺板密度和抗体的特异性要求较高，容易出现假阳性现象。2)流式检测法，即用hPSC特异性标志物(e.g.SSEA4和Tra
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81)的流式抗体，对待检细胞进行检测，可以检测hPSC的残留。但是该方法灵敏性较低，即在hPSC存在较多的情况下才能够检测到，且该方法对细胞量和抗体使用量/活性敏感，标准化比较困难。3)培养法，即使用hPSC培养条件，培养待检细胞10～14天，未分化的hPSC经培养形成肉眼可见的克隆；挑出克隆后，可以通过检测多能性基因表达来确认。在培养前，待检细胞中残留的hPSC也可以通过磁珠筛选或流式富集。这种方法可以有效地检测到hPSC残留，但是该方法需要10～14天检测时间，同时会有功能细胞诱导残留hPSC分化产生假阴性的可能。4)RT
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qPCR检测方法，相对于抗体染色(免疫荧光法、流式检测法)和培养法，它是一种时间短、灵敏度高、操作相对简单的方法，且有望实现定量分析。通过检测hPSC特异性基因的表达来实现hPSC残留检测的目的。在RT
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qPCR检测前，待检细胞中残留的hPSC也可以通过磁珠筛选或流式富集，或用培养法扩增hPSC以提高检测灵敏度。作为检测诱导的功能细胞中hPSC残留检测的基因需要满足以下两个条件：
①
该基因特异性的在hPSC中大量表达；
②
该基因在诱导分化的细胞或成体人功能细胞中不表达或极微量表达。常用的hPSC特异性基因包括SOX2、POU5F1、ESRG、LIN28A、NANOG以及TDGF1等，这些基因并不一定都能普适性地适用于不同种类的由
hPSC诱导分化而来的功能细胞。例如，Sox2是一个常见的hPSC特异性基因，但它在神经干细胞中也会有表达，因此Sox2就并不适用于检测诱导的神经干细胞或神经前体细胞中hPSC的残留；此外，现有技术能够通过RT
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qPCR检测Lin28A用于检测hPSC诱导的视网膜色素上皮细胞(RPE)中残留的hPSC，该方法已应用于患者，但研究表明，LIN28A在诱导的肝脏细胞、内皮细胞以及胰岛小体等细胞中都有表达，因此，LIN28A并不适用于这些功能细胞中的hPSC残留检测。
[0004]目前，专利公开号CN110573607A的专利公开了一种用于检测多能干细胞(PSC)分化的细胞培养物中残留的未分化PSC的方法，该方法包括细胞的培养；对培养的细胞进行多能性鉴定，鉴定的方法主要是利用qRT
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PCR的方法对LIN28(Lin28A)、OCT4(POU5F1)、SOX2、FOXD3、NANOG、PODXL、REX1(ZFP42)、SSEA1(FUT4)、DPPA2和DPPA3基因的检测，并利用参比细胞(MSC)和所培养的细胞中多能性的标记物进行对比，来确定所培养的细胞中不存在残留的未分化PSC或者所培养的细胞中残留的未分化PSC的存在比例低于在MSC中PSC的已知比例。可见，该方法中涉及多种多能性基因，而有些基因在一些特殊的体细胞中有明显表达，例如LIN28A在hiPSC诱导的肝脏和内皮等细胞中能够检测到表达，因此不能用于此类诱导型功能细胞中hiPSC残留的检测；SOX2在神经细胞中会有表达，因此不适用于检测hPSC诱导的神经细胞中hPSC的残留。除此之外，专利1中的方法还涉及培养法，大大增加了检测时间。专利申请号202010813518.2的专利公开了一种使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法，具体使用ESRG基因作为通用标记基因的iPSC残留检测方法，所述的检测方法是通过qPCR定量检测样本中的ESRG基因，并将其与标准品进行对比，从而得到样品中iPSC残留的数量；但是，专利2中并没有说明ESRG基因在qPCR方法中的检测灵敏度，因此，我们虽然知道该方法相对于培养法更加迅速，但是并没有保证使用ESRG基因作为通用标记基因检测iPSC残留方法的可信度。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用，TDGF1在分化细胞或原代细胞中表达极低，适于检测hPSC来源的多种功能细胞中的hPSC残留。
[0006]本专利技术提供了TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。
[0007]优选的，所述TDGF1包括TDGF1基因和TDGF1蛋白；
[0008]所述TDGF1基因包括以下至少一种DNA片段：
[0009]1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；
[0010]2)与如SEQ ID NO:1所示序列互补的DNA序列；
[0011]3)在TDGF1基因全长序列的基础上截取总长度6％以上的DNA序列。
[0012]优选的，所述TDGF1基因包括TDGF1亚型1和TDGF1亚型2，所述TDGF1基因亚型1全长序列的cDNA具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；所述TDGF1基因亚型2全长序列的cDNA具有如SEQ ID NO:9序列。
[0013]本专利技术提供了一种用于检测人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TDGF1在人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留检测中应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述TDGF1包括TDGF1基因或/和TDGF1蛋白；所述TDGF1基因包括以下至少一种DNA片段：1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段；2)与如SEQ ID NO:1所示序列互补的DNA序列；3)在TDGF1基因全长序列的基础上截取总长度6％以上的DNA序列。3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于：所述TDGF1基因包括TDGF1亚型1和TDGF1亚型2，所述TDGF1基因亚型1全长序列的cDNA具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；所述TDGF1基因亚型2全长序列的cDNA具有如SEQ ID NO:9序列。4.一种用于检测人多能干细胞来源功能细胞产品中多能干细胞残留的试剂盒，其特征在于，包括检测TDGF1基因或TDGF1蛋白表达量的试剂。5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，检测TDGF1基因表达量的试剂为扩增TDGF1基因用引物对；优选的，所述扩增TDGF1基因用引物对包括SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦璐琰，俞君英，张颖，
申请(专利权)人：安徽中盛溯源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：