一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法，试纸条包括底板，底板上设置有样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，样品吸收垫、结合物释放垫和吸水垫分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫的两端上，样品吸收垫、结合物释放垫上分别包被有抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗TFNA和TFNA

【技术实现步骤摘要】
一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法


[0001]本专利技术涉及农药检测领域，尤其涉及一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法。

技术介绍

[0002]氟啶虫酰胺(Flonicamid)，又名N
‑
氰甲基
‑4‑
(三氟甲基)烟酰胺，是一种新型的有选择性的低毒吡啶酰胺类杀虫剂，对蚜虫等各种刺吸式口器害虫有效，该药剂通过阻碍害虫吮吸作用而致效，害虫摄入药剂后很快停止吮吸，最后饥饿而死。因为氟啶虫酰胺具有最小抵抗力交叉和哺乳动物急性毒性较低的特点，目前已被许多国家广泛使用在农作物上，如水稻、水果和蔬菜，用于控制蚜虫和其他刺吸式口器昆虫。氟啶虫酰胺作为一种较为新颖的杀虫剂具有广阔的未来市场，目前其单剂或复配制剂在我国的登记数量已达近三十种农作物。例如，专利号为ZL 201210119923.X(授权公告号为CN102696607A)的中国专利技术专利公开的氟啶虫酰胺微乳剂；申请号为CN201310722767.0(公开号为CN104719294A)的中国专利技术专利公开的含氟啶虫酰胺与烯啶虫胺的杀虫组合物等。
[0003]嘧菌酯(Azoxystrobin)是一种高效且广谱的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，对几乎所有真菌纲病害均有良好的活性。目前，嘧菌酯单剂及复配制剂在我国已被登记于黄瓜、苹果、水稻等多种农作物上。例如，申请号为CN201711164864.7(公开号为CN109805015A)的中国专利技术专利公开的含有氟啶虫酰胺和嘧菌酯的组合物等。
[0004]然而，氟啶虫酰胺和嘧菌酯均可携带到农产品中，并增加人类接触。为了保护消费者的健康，采用灵敏可靠的分析方法对氟啶虫酰胺的残留进行监测具有重要意义。近年来，许多氟啶虫酰胺残留的测定方法在不同类型的样本已被报道，这些方法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱质谱(HPLC
‑
MS)。例如，申请号为CN202010953349.2(公开号为CN112114066A)的中国专利技术专利《共同基团法结合UPLC
‑
MSMS检测植物源农产品中氟啶虫酰胺及其代谢物的方法》；专利号为ZL201510528547.3(授权公告号为CN105116090A)的中国专利技术专利《一种嘧菌酯检测方法》。
[0005]虽然这些方法具有很高的精度和灵敏度，但它们需要长时间的样品前处理程序和复杂的仪器分析程序，同时这些仪器也不适于大规模和现场分析。因此，要求采用更简单、更经济的方法来测定氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯的残留量，而免疫分析正好满足这些要求，是筛选分析的可靠分析工具。此外，相对于酶联免疫吸附检测方法，荧光免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术以及免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相对于传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，因此荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限，而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性，形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此荧光微球免疫层
析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点，易于在基层普及和推广，可满足快速分析检测的需要，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种灵敏度高、特异性强的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条。
[0007]本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种操作方便、成品率高的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法。
[0008]本专利技术所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种有操作简便、灵敏度高、结果简单可视的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的检测方法。
[0009]本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，该底板上依次设置有样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，上述样品吸收垫、结合物释放垫和吸水垫分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫的两端上，上述样品吸收垫、结合物释放垫上分别包被有时间分辨荧光微球标记的抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗TFNA和TFNA
‑
AM多克隆抗体、抗TFNG和TFNG
‑
AM多克隆抗体、抗嘧菌酯多克隆抗体，
[0010]而上述硝酸纤维素膜检测垫上分别设有检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4和质控线C线，各检测线均为能与对应的上述多克隆抗体特异性结合的半抗原
‑
卵清蛋白偶联物的涂层，其中，检测线T1用于检测氟啶虫酰胺的残留，检测线T2用于检测代谢物TFNA和TFNA
‑
AM的残留，检测线T3用于检测代谢物TFNG和TFNG
‑
AM的残留，检测线T4用于检测嘧菌酯的残留，质控线C线为包被有羊抗鼠IgG。
[0011]进一步，所述检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4和质控线C线分别沿上述硝酸纤维素膜检测垫的长度方向依次设置且相互平行，其中，质控线C线与吸水垫的距离最近。
[0012]进一步，所述硝酸纤维素膜检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸，所述样品吸收垫、结合物释放垫的材质均为玻璃纤维素膜。
[0013]为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014](一)半抗原、完全抗原、包被原及多克隆抗体的制备；
[0015](二)试纸条的制备：
[0016](1)时间分辨荧光微球标记抗体；
[0017](2)结合物释放垫的制备；
[0018](3)样品吸收垫的制备；
[0019](4)硝酸纤维素(NC)膜检测垫的制备；
[0020](5)试纸条的组装；其中，上述半抗原包括第一半抗原、第二半抗原以及第三半抗原，上述各半抗原的制备分别包括以下步骤：
[0021]第一半抗原的制备：
[0022]A液的制备：称取适量TFNG
‑
AM溶解于甲酸、盐酸、氰酸及水的混合液中，0～5℃冰浴反应30min，反应过程中，边搅拌边缓慢加入适量浓度为1mol/L的亚硝酸钠水溶液；
[0023]B液的制备：称取适量过硫化钠并加热溶解在水中，得所需的B液，冷却备用；
[0024]C液的制备：0～5℃条件下，将上述制备的B液加入至A液中并搅拌均匀，调节pH值为7～8，恒温反应2h得C液；
[0025]第一半抗原的制备：在上述C液中加入适量锌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板(4)，该底板(4)上依次设置有样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)、硝酸纤维素膜检测垫(2)和吸水垫(3)，上述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)和吸水垫(3)分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫(2)的两端上，上述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)上分别包被有时间分辨荧光微球标记的抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗TFNA和TFNA
‑
AM多克隆抗体、抗TFNG和TFNG
‑
AM多克隆抗体、抗嘧菌酯多克隆抗体，而上述硝酸纤维素膜检测垫(2)上分别设有检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4和质控线C线，各检测线均为能与对应的上述多克隆抗体特异性结合的半抗原
‑
卵清蛋白偶联物的涂层，其中，检测线T1用于检测氟啶虫酰胺的残留，检测线T2用于检测代谢物TFNA和TFNA
‑
AM的残留，检测线T3用于检测代谢物TFNG和TFNG
‑
AM的残留，检测线T4用于检测嘧菌酯的残留，质控线C线为包被有羊抗鼠IgG。2.如权利要求1所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述检测线T1、检测线T2、检测线T3、检测线T4和质控线C线分别沿上述硝酸纤维素膜检测垫(2)的长度方向依次设置且相互平行，其中，质控线C线与吸水垫(3)的距离最近。3.如权利要求1所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜(2)检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔膜，所述吸水垫(3)的材质为吸水滤纸，所述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)的材质均为玻璃纤维素膜。4.一种如权利要求1～3任一项所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)半抗原、完全抗原、包被原及多克隆抗体的制备；(二)试纸条的制备：(1)时间分辨荧光微球标记抗体；(2)结合物释放垫的制备；(3)样品吸收垫的制备；(4)硝酸纤维素(NC)膜检测垫的制备；(5)试纸条的组装；其中，上述半抗原包括第一半抗原、第二半抗原以及第三半抗原，上述各半抗原的制备分别包括以下步骤：第一半抗原的制备：A液的制备：称取适量TFNG
‑
AM溶解于甲酸、盐酸、氰酸及水的混合液中，0～5℃冰浴反应30min，反应过程中，边搅拌边缓慢加入适量浓度为1mol/L的亚硝酸钠水溶液；B液的制备：称取适量过硫化钠并加热溶解在水中，得所需的B液，冷却备用；C液的制备：0～5℃条件下，将上述制备的B液加入至A液中并搅拌均匀，调节pH值为7～8，恒温反应2h得C液；第一半抗原的制备：在上述C液中加入适量锌粉和冰乙酸，加热回流反应30min后冷却，pH为8、温度37℃的条件下，加入碘乙酰胺，得到的溶液放入冰箱中静置过夜，析出晶体；减压抽滤、洗涤，40℃下真空烘干，干燥后的粗产品重结晶得纯品第一半抗原；第二半抗原的制备：D液的制备：称取适量TFNA
‑
AM溶解于乙醇，依次加入甲酸水溶液和甲醛水溶液，在室温
下搅拌1.0h，加热升温至87℃使其回流，至薄层色谱跟踪无TFNA
‑
AM后停止反应，得D液；E液的制备：上述制备的D液自然冷却至室温，乙酸乙酯萃取，取水层，将水层降温后用氢氧化钠水溶液调至pH 9～10，乙酸乙酯萃取，静置分层后合并有机相，有机层经洗涤分出有机相，得E液；在容器中依次加入上述E液、氰酸、N,N
‑
二甲基甲酰胺以及碘化钠得混合液，将所得混合液在微波强度为300W及温度为100℃的条件下微波搅拌反应10min，反应结束后，用乙酸乙酯溶解反应物，饱和食盐水洗涤溶液，真空浓缩有机相液，真空干燥的所需的第二半抗原；第三半抗原的制备：F液：称取适量3
‑
(6
‑
羟基苯基)
‑
丙酮，在0℃且干燥的条件下溶解于DMF中，加入到质量浓度60％的NaH悬浮液中，搅拌45min后，在0℃下加入适量甲酸甲酯，在室温下继续搅拌1h后，在0℃下加入适量硫酸二甲酯，0℃条件下搅拌20min后，用饱和NH4Cl溶液淬火反应；G液：取适量上述制备的F液和K2CO3的悬浊液中加入适量4,6
‑
二氯嘧啶，室温下搅拌3天，得G液；H液：称取适量4
‑
(4
‑
羟基
‑3‑
甲基苯基)
‑2‑
丁酮和K2CO3加入DMF中，接着加入G液，室温下搅拌4天；称取适量LiOH溶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾惠言，吴银良，陈道定，付岩，张亮，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：