一种新型HPV治疗性核酸疫苗制造技术

本发明专利技术提供的核酸序列，包括1:1的HPV16

【技术实现步骤摘要】
一种新型HPV治疗性核酸疫苗


[0001]本专利技术涉及肿瘤的免疫治疗和预防，具体涉及一种新型HPV治疗性核酸疫苗。

技术介绍

[0002]全世界大约20
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25%的癌症病例都是由传染源引起的。其中约15%的人类癌症与病毒感染有关。人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV) 引起了约 30% 的所有传染源相关癌症，并且与超过95%的宫颈癌有关。2018年，全球有超过300000 名女性死于宫颈癌。这是高危人乳头瘤病毒 (high risk HPV，hrHPV)持续感染的结果。
[0003]目前HPV预防性疫苗已上市，预防性疫苗通过诱导针对主要衣壳蛋白 L1的类型特异性中和抗体来预防持续性宫颈感染。然而它们对预先存在的HPV感染或癌前病变治疗效果不显著。另外，现有的宫颈癌治疗方法均疗效有限，且由于全球范围内的HPV预防接种率不理想，HPV感染和随后发生的HPV相关恶性肿瘤将在未来几十年仍然是公共卫生问题。因此，开发治疗性HPV疫苗和其他癌症疗法是一项紧迫的任务。
[0004]已知早期蛋白E6和E7是导致 HPV 相关癌症的恶性进展的原因，E6可以结合和降解肿瘤抑制因子 p53，而 E7 通过抑制 pRb 从而使细胞周期不受控制地进入 S 期。因此，HPV E6和E7 癌蛋白可作为治疗性 HPV 疫苗的理想靶标，目前绝大多数 HPV 治疗性疫苗都靶向这两种抗原。然而，这些靶向E6 和 E7的疫苗对 HPV相关癌症的疗效非常有限。主要原因可能包括以下几点： E6 和 E7 在上皮基底膜细胞中仅适度表达，它可能在恶性细胞中上调之前，成功地逃避对过度表达的 E6 和 E7 的免疫，最终引起持续的病毒感染；E6和E7蛋白较小，包含的抗原表位较少；现有的治疗性疫苗抗原表达水平偏低，递送效率低，结构设计不完善，不能引起足够的免疫反应强度。因此，可能需要更广泛的抗原靶向策略和抗原序列设计来治疗HPV+ 癌症和清除持续的癌前感染。
[0005]HPV有两种衣壳蛋白，分别是L1和L2，其中L1是主要的衣壳蛋白，L2可以稳定病毒衣壳结构。目前的HPV预防性疫苗是L1蛋白表达出来后自己会组装成病毒样颗粒（virus
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like
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particle，VLP），可诱导人体产生中和抗体，表现出很好的预防HPV感染效果。VLP作为亚单位蛋白疫苗刺激细胞免疫反应强度较弱，因此表现出有限的治疗效果。研究结果显示L1和L2的DNA疫苗形式，同时可以引起很强的体液免疫和细胞免疫，体现了作为治疗性疫苗靶标的潜力。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过对HPV16和HPV18 的E6、E7、L1和L2的抗原序列设计以及密码子优化；融合L1/L2辅助T细胞表位，两个全长E6和两个全长E7蛋白，佐剂序列Beta defensin
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3和通用Th表位PADRE序列设计出新型HPV治疗性核酸疫苗AVL101核酸序列。AVL101共包括四条核酸序列，每条疫苗序列不仅包含两个全长E6和两个全长E7蛋白，也同时包含了L1/L2的辅助T细胞的免疫表位序列。该序列组合不仅可以诱导高效价的抗E6/E7抗体，同时还能高效诱导T细胞免疫，最终表现出高效抑制表达E6/E7的癌细胞的生长。
[0007]具体的，本专利技术提供一种用于治疗和预防HPV感染疾病的核酸序列，包括：1:1的序列HPV16
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AVLS1和序列HPV16
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AVLC1；以及，1:1的序列HPV18
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AVLS1和序列HPV18
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AVLC1；优选为1:1:1:1的HPV16
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AVLS1、HPV16
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AVLC1、HPV18
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AVLS1和HPV18
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AVLC1；其中，序列AVLS1和序列AVLC1分别包括两个串联的蛋白E6分子、两个L1短肽，两个L2的短肽、两个串联的蛋白E7分子、一个PADRE序列及一个adjuvant序列。
[0008]所述L1短肽选自SEQ ID No：1~SEQ ID No：4所示序列中的至少一种；所述L2短肽选自SEQ ID No：5~SEQ ID No：8所示序列中的至少一种；序列AVLS1的N端带有小鼠IgK分泌肽序列；序列AVLC1的N端带有泛素分子。
[0009]本专利技术通过对HPV16的E6、E7、L1和L2的抗原序列组合设计以及密码子优化提供了用于治疗HPV16或HPV18 或两者共感染的相关疾病的DNA疫苗序列。
[0010]本专利技术AVLS1与AVLC1编码蛋白序列的差别只在N端，其余序列均一样。AVLS2的N端带有一段小鼠IgK分泌肽序列，可以促进蛋白分泌到细胞外被抗原呈递细胞捕获而被呈递，进而促进辅助T细胞免疫响应；而AVLC1 的带有一段泛素(ubiquitin)分子，可以促进蛋白的降解进而增强CD8+ T细胞免疫。其余相同的部分包括两个完整的E6分子，两个L1短肽，两个L2的短肽，两个完整的E7分子，一个PADRE序列及一个adjuvant序列。本专利技术提供的L1和L2的短肽是助细胞免疫结合表位序列（helper T Cell epitope），将其引入DNA疫苗序列的可以帮助刺激增强对HPV感染细胞的CTL杀伤；本专利技术为了克服HLA
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2等位基因的高多态性，在构建过程中添加了通用的PADRE (Pan
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HLA DR)序列；其中，所述PADRE序列为SEQ ID No：9。
[0011]同时，本专利技术在C末端加了一段佐剂肽Beta
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defensin
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3，该肽可以作为Toll样受体 (toll like receptor)的激动剂促进先天免疫。其中，所述adjuvant序列为SEQ ID No：10。
[0012]其中，所述小鼠IgK分泌肽序列为SEQ ID No：11；其中，所述泛素分子的序列为SEQ ID No：12。
[0013]其中，各个元件之间使用AGA(Ala
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Gly
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Ala)或AAY (Ala
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Ala
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Tyr)连接子；佐剂肽使用刚性连接子EAAAK(Glu
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Ala
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Ala
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Ala
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Lys)连接；这些连接子将确保最大的免疫原性和抗原表位的呈递。最终疫苗结构图如图1所示。
[0014]本专利技术提供的，HPV16融合蛋白E6序列引入C70G和I135T突变，HPV18融合蛋白E6序列引入C65G和I130T突变，消除它们降解p53的能力；HPV16的E7蛋白序列引入C24G和E26G突变，HPV18的E7蛋白序列引入C27G和E29G突变，使它们E7蛋白失去恶性转化的能力。
[0015]优选的，所述核酸序列为SEQ ID No：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗和预防HPV感染疾病的核酸序列，其特征在于，包括：1:1的序列HPV16
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AVLS1和序列HPV16
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AVLC1；以及，1:1的序列HPV18
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AVLS1和序列HPV18
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AVLC1；其中，序列AVLS1和序列AVLC1均包括两个串联的蛋白E6分子、两个L1短肽，两个L2的短肽、两个串联的蛋白E7分子、一个PADRE序列及一个adjuvant序列；序列AVLS1的N端带有小鼠IgK分泌肽序列；序列AVLC1的N端带有泛素分子；所述L1短肽选自SEQ ID No：1~SEQ ID No：4所示序列中的至少一种；所述L2短肽选自SEQ ID No：5~SEQ ID No：8所示序列中的至少一种。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述PADRE序列为SEQ ID No：9所示序列；和/或，所述adjuvant序列为佐剂肽Beta
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defensin
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3，为SEQ ID No：10所示序列；和/或，所述小鼠IgK分泌肽序列为SEQ ID No：11所示序列；和/或，所述泛素分子的序列为SEQ ID No：12所示序列。3.根据权利要求1或2任一项所述的核酸序列，其特征在于，HPV16融合蛋白E6序列引入C70G和I135T突变，HPV18融合蛋白E6序列引入C65G和I130T突变； HPV16的E7蛋白序列引入C24G和E26G突变，HPV18的E7蛋白序列引入C27G和E29G突变。4.根据权利要求3所述的核酸序列，其特征在于，各个元件之间使用AGA或AAY连接子；佐剂肽使用刚性连接子EAAAK连接。5.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列为SEQ ID No：13~ SEQ ID No：16所示四条序列之一。6.mRNA序列，其特征在于，所述mRNA序列为权利要求1~5任一项所述核酸序列转换的mRNA序列。7.重组载体，其特征在于，包括表达载体和权利要求1~5任一项所述的核酸序列；所述表达载体为无抗生素标记的AVL0318载体。8.扩增权利要求7所述重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将E6/E7蛋白、L1/L2多肽与IgK，Ubquitin，PADRE和adjuvant的氨基酸序列进行拼接合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀军，刘磊，唐建明，
申请(专利权)人：北京循生生物医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：