一种SARM1酶抑制剂及其筛选方法和应用技术

本申请公开了一种SARM1酶抑制剂及其筛选方法和应用。本申请的SARM1酶抑制剂筛选方法包括，将SARM1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，常温反应，检测反应过程中荧光产生的速率，如果该荧光速率小于标准荧光速率，则判断候选抑制剂具有SARM1酶抑制剂活性；标准荧光速率是指在相同条件下，没有添加候选抑制剂时检测的反应过程中荧光产生的速率；荧光探针为吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的荧光探针。本申请筛选方法能够简单的获得大量的能有效抑制SARM1酶的活性SARM1酶抑制剂，从而为抑制轴突变性和疾病进程，治疗轴突变性相关的神经退行性疾病，提供了一种新的方案和途径。了一种新的方案和途径。了一种新的方案和途径。

【技术实现步骤摘要】
一种SARM1酶抑制剂及其筛选方法和应用


[0001]本申请涉及SARM1酶抑制剂
，特别是涉及一种SARM1酶抑制剂及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]SARM1是新发现的信号酶，在轴突变性过程中起着执行者的作用，而轴突变性是创伤性脑损伤、帕金森疾病、化疗药物诱导的周围神经病变等许多神经性疾病的早期事件。在多种神经退行性疾病中，SARM1被激活，导致NAD和ATP耗竭，线粒体功能障碍，进而启动一个全新的细胞死亡机制；敲除SARM1能够抑制轴突变性和疾病进程，因此被认为是治疗轴突变性相关疾病的潜在药物靶点。
[0003]虽然，基因敲除SARM1，能够抑制轴突变性和疾病进程；但是，在临床应用中，对于患病个体很难有效的实施SARM1基因敲除技术，或者说，通过基因敲除SARM1实现治疗的效果有限。因此，如何有效的阻断SARM1执行的轴突变性相关的神经退行性疾病，从而起到有效治疗的效果，仍然是目前SARM1研究的重点和难点。

技术实现思路

[0004]本申请的目的是提供一种新的SARM1酶抑制剂的筛选方法，以及由此筛选获得的SARM1酶抑制剂及其应用。
[0005]本申请采用了以下技术方案：
[0006]本申请的一方面公开了一种SARM1酶抑制剂的筛选方法，包括：
[0007]将SARM1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和荧光探针混合，制成反应体系，在常温进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为第一荧光速率；
[0008]如果第一荧光速率小于标准荧光速率，则判断候选抑制剂具有SARM1酶抑制剂活性；第一荧光速率小于标准荧光速率的程度越大，相应的候选抑制剂的抑制活性越强；
[0009]其中，标准荧光速率是指在相同条件下，没有添加候选抑制剂时检测的反应过程中荧光产生的速率，即将相同量SARM1酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在相同反应条件进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为标准荧光速率；荧光探针为吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的用于SARM1酶促活性检测的荧光探针。
[0010]需要说明的是，本申请的筛选方法，其关键在于利用SARM1酶的NAD碱基交换活性。在荧光探针存在的情况下，荧光探针与NAD的烟酰胺发生交换，形成具有荧光的物质，即产物PADs，SARM1酶能够促进NAD碱基交换。也就是说，可以通过酶标仪检测底物PCs和产物PADs的吸光波谱动力学以及产物PADs的荧光波谱动力学，表征SARM1的酶促活性；即可以根据荧光产生的速率判断SARM1酶的活性强度。因此，如果候选抑制剂能够抑制SARM1酶活性，则荧光产生的速率会减小；抑制剂作用越强，减小的程度越大。本申请正是基于以上研究进行的SARM1酶抑制剂筛选。
[0011]还需要说明的是，本申请的SARM1酶抑制剂筛选方法，其关键在于基于SARM1酶活性检测；也就是说，SARM1酶抑制剂筛选方法的准确性和有效性，是基于特异性强、灵敏度高的SARM1酶活性检测才成立的。其中，吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的荧光探针，就是本申请专利技术人在之前的专利申请中提出的一种新的检测物质，其具有特异性强、灵敏度高和膜透性强等优点，能够在体外或活细胞内实时检测SARM1的酶促活性或其激活过程。本申请的荧光探针可以参考专利申请202010489831.5，该专利申请中与SARM1酶促活性检测相关的全部内容引用至本申请。
[0012]本申请的一种实现方式中，荧光探针为PC1所示结构至PC15所示结构中的至少一种；
[0013][0014]优选的，荧光探针为PC5、PC6、PC7、PC8、PC10或PC11所示结构，更优选PC6和PC11。
[0015]需要说明的是，PC1所示结构至PC15所示结构的荧光探针是本申请专利技术人已经证实的能够用于检测SARM1酶促活性的荧光探针，在此基础上，还可以设计合成更多的荧光探针，例如，在吡啶环或苯烯基的基础上修饰，从而制备获得更多的新的荧光探针。
[0016]还需要说明的是，PC5、PC6、PC7、PC8、PC10和PC11是本申请一种实现方式中证实活性较佳的荧光探针，其它荧光探针的活性相对较差；因此，在优选的方案中优选PC5、PC6、PC7、PC8、PC10或PC11。当然，在要求较低的情况下，也可以采用其它九种荧光探针。
[0017]本申请的一种实现方式中，还包括在反应体系中添加激活剂，促进反应进行。
[0018]优选的，激活剂为烟酰胺单核苷酸或其类似物。
[0019]需要说明的是，激活剂的作用是解除SARM1分子内自抑制，激活酶促活性；可以理
解，只要具备该作用都可以作为本申请的激活剂或者激活方法使用。本申请的一种实现方式中具体采用的是烟酰胺单核苷酸或CZ
‑
48。当然，如果使用的是克隆的已经解除自抑制的SARM1酶，则可能不需要激活剂。
[0020]本申请的一种实现方式中，第一荧光速率的反应体系和反应条件具体包括，先将SARM1酶和候选抑制剂在Tris
‑
HCl溶液中孵育至少10分钟，然后向其中加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针，常温下反应至少30分钟，检测反应过程中荧光产生的速率，即第一荧光速率。如果需要添加烟酰胺单核苷酸或其类似物激活剂，则将其与荧光探针一起加入。
[0021]同样的，标准荧光速率的反应体系和反应条件具体包括，先将SARM1酶在Tris
‑
HCl溶液中孵育至少10分钟，然后向其中加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针，常温下反应至少30分钟，检测反应过程中荧光产生的速率，即标准荧光速率。如果需要添加烟酰胺单核苷酸或其类似物激活剂，则将其与荧光探针一起加入。
[0022]至于反应体系中SARM1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针等的浓度，以能够有效的产生荧光为准，可以参考本申请实施例的浓度或根据检测需求进行调整。
[0023]本申请的另一方面公开了一种采用本申请的筛选方法获得的SARM1酶抑制剂。
[0024]需要说明的是，本申请筛选方法获得的SARM1酶抑制剂，可以根据需求筛选所需要的抑制剂活性，更好的满足轴突变性相关的神经退行性疾病临床应用。
[0025]本申请的一种实现方式中，本申请筛选方法获得的SARM1酶抑制剂包括硝苯地平(Nifedipine,NFDP)、尼索地平(Nisodipine,NSDP)、尼卡地平(Nicardipine,NCDP)、尼莫地平(Nimodipine,NMDP)、氨氯地平(Amlodipine)、非洛地平(Felodipine)、丁酸氯维地平(Clevidipine butyrate)、依拉地平(Isradipine)、地尔硫(Diltiazem)、维拉帕米(Verapamil)、脱氢亚硝基硝苯地平(dHN
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Nifedipine,dHN
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NFDP)、脱氢亚硝基尼索地平(d本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SARM1酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：包括，将SARM1酶、候选抑制剂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在常温进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为第一荧光速率；如果第一荧光速率小于标准荧光速率，则判断候选抑制剂具有SARM1酶抑制剂活性；第一荧光速率小于标准荧光速率的程度越大，相应的候选抑制剂的抑制活性越强；所述标准荧光速率是指在相同条件下，没有添加候选抑制剂时检测的反应过程中荧光产生的速率，即将相同量的SARM1酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和荧光探针混合，制成反应体系，在相同的反应条件进行反应，检测反应过程中荧光产生的速率，标记为标准荧光速率；所述荧光探针为吡啶环与苯烯基或苯烯基衍生物偶联而成的用于SARM1酶促活性检测的荧光探针。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述荧光探针为PC1所示结构至PC15所示结构中的至少一种；优选的，所述荧光探针为PC5、PC6、PC7、PC8、PC10或PC11所示结构；更优选的，所述荧光探针为PC6或PC11所示结构。3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于：还包括在反应体系中添加激活剂，促进反应进行；优选的，所述激活剂为烟酰胺单核苷酸或其类似物。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的筛选方法获得的SARM1酶抑制剂。
5.根据权利要求4所述的SARM1酶抑制剂，其特征在于：所述SARM1酶抑制剂包括硝苯地平、尼索地平、尼卡地平、尼莫地平、氨氯地平、非洛地平、丁酸氯维地平、依拉地平、地尔硫维拉帕米、脱氢亚硝基硝苯地平、脱氢亚硝基尼索地平、脱氢亚硝基尼卡地平、脱氢亚硝基尼莫地平、脱氢氨氯地平、脱氢非洛地平、脱氢丁酸氯维地平、脱氢依拉地平、盐酸表柔比星、奥利万星二磷酸盐、苄索氯铵、盐酸小檗碱、双烯雌酚、帕西替尼、戊酸雌二醇、汞溴红、苹果酸舒尼替尼、甲萘醌、次水杨酸铋、酚酞、碱式没食子酸铋、血根碱盐酸盐、埃文斯蓝、甲紫、西曲溴铵、吡啶硫酮锌、卡铂...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永娟，李汉璋，黎婉华，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：