4-磷酸赤藓糖的检测方法技术

本发明专利技术提供4

【技术实现步骤摘要】
4
‑
磷酸赤藓糖的检测方法


[0001]本专利技术属于糖的检测领域，尤其涉及4
‑
磷酸赤藓糖的检测方法，进一步涉及4
‑
磷酸赤藓糖的荧光定量检测方法。

技术介绍

[0002]4‑
磷酸赤藓糖是光合作用卡尔文循环的中间代谢产物，它是莽草酸途径和苯丙烷类代谢的前体物质，是合成芳香族氨基酸—色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的前体物质，同时4
‑
磷酸赤藓糖是6
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磷酸葡萄糖异构酶的抑制剂。叶绿体中的6
‑
磷酸葡萄糖异构酶催化淀粉合成的第一步反应，4
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磷酸赤藓糖能够通过调控6
‑
磷酸葡萄糖异构酶活性调控淀粉的合成。因此，建立准确、快速的定量分析方法是探索4
‑
磷酸赤藓糖在植物光合作用及淀粉合成中作用的关键。
[0003]糖的检测方法主要有气相色谱、液相色谱法、离子色谱法。气相色谱检测糖需要衍生化；由于糖的紫外吸收很弱，一般采用示差折光检测器，但其灵敏度较低。离子色谱检测糖灵敏度较高，但是糖的化学性质相近，分离难度较大。
[0004]因此，迫切需要一种能够以高灵敏度特异性检测4
‑
磷酸赤藓糖的方法。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供体外4
‑
磷酸赤藓糖的快速荧光定量检测方法，具体包括如下技术方案：
[0006]一方面，本专利技术提供4
‑
磷酸赤藓糖的检测方法，其特征在于，所述方法包括使4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂反应的步骤。
[0007]在一些实施方案中，所述衍生剂选自3,5
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二氨基苯甲酸和3
‑
氨基苯甲酸。
[0008]在一些实施方案中，所述4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂的浓度比为1:10。
[0009]在一些实施方案中，使4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂反应的步骤包括使4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂在80
‑
100℃反应20
‑
30min的步骤。
[0010]在一些实施方案中，所述方法还包括4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂反应后在冰上孵育的步骤。
[0011]在一些实施方案中，所述冰上孵育的时间为5
‑
10min。
[0012]在一些实施方案中，所述方法包括对4
‑
磷酸赤藓糖与衍生剂的反应产物于激发光360/40nm，发射光528/20nm检测荧光值的步骤。
[0013]在一些实施方案中，所述方法还包括制备标准曲线，并计算4
‑
磷酸赤藓糖的浓度的步骤。
[0014]在一些实施方案中，所述标准品的浓度为0.1
‑
1mM。
[0015]另一方面，本专利技术还提供监测光合作用或调控淀粉合成的方法，其特征在于使用上述方法中的步骤。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术利用衍生剂例如3,5
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二氨基苯甲酸和3
‑
氨基苯甲酸化学衍生磷酸糖，低浓度(0
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1mM)时，卡尔文中间代谢产物中，只有4
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磷酸赤藓糖的衍生物具有明显荧光，用荧光法在体外实现定量检测。本专利技术的整个检测过程的检测时间约20
‑
30min，可快速实现4
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磷酸赤藓糖的荧光定量检测。
附图说明
[0018]图1示出了以3,5
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二氨基苯甲酸作为衍生剂的衍生物的荧光分析结果。
[0019]图2示出了4
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磷酸赤藓糖(E4P)、3
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磷酸甘油醛(G3P)和磷酸二羟丙酮糖(DHPA)的荧光定量检测标准曲线图。
[0020]图3示出4
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磷酸赤藓糖与3,5
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二氨基苯甲酸衍生反应过程的示意图。
[0021]图4示出4
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磷酸赤藓糖(E4P)与3,5
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二氨基苯甲酸的反应温度对荧光值的影响。
[0022]图5示出4
‑
磷酸赤藓糖(E4P)与3,5
‑
二氨基苯甲酸的反应时间对荧光值的影响。
[0023]图6示出磷酸糖与3
‑
氨基苯甲酸的反应结果。
具体实施方式
[0024]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。
[0025]本专利技术中采用的试剂详情如下：
[0026][0027]实施例1磷酸糖的3,5
‑
二氨基苯甲酸衍生物的荧光检测
[0028]将150μL的1mM的3
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磷酸甘油酸(3PGA)，3
‑
磷酸甘油醛(G3P)，磷酸二羟丙酮(DHPA)，1，6
‑
二磷酸果糖(FBP)，7
‑
磷酸景天庚酮糖(S7P)，6
‑
磷酸果糖(F6P)，5
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磷酸核糖(R5P)，5
‑
磷酸核酮糖(Ru5P)，4
‑
磷酸赤藓糖(E4P)，NAD
+
，ATP，1,5
‑
二磷酸核酮糖(RuBP)，乙醇酸(GA)，焦磷酸硫胺素(TPP)，2
‑
磷酸乙醇酸(2PGA)分别与等体积的10mM 3,5
‑
二氨基苯甲酸(溶于5M磷酸)于100℃反应15min后，冰上孵育10min，然后取80μL于黑色96孔平板中，多功能微孔板检测仪于激发光360/40nm(360nm，带宽为40nm)，发射光528/20nm(528nm，带宽20nm)，光学元件：顶部，增益：自动调整，检测荧光值(顶部、增益是多功能微孔板检测仪里设置选项)。发现4
‑
磷酸赤藓糖、3
‑
磷酸甘油酸和磷酸二羟丙酮的3,5
‑
二氨基苯甲酸的衍生物具有明显的荧光，其荧光值分别为5.7*105，9.9*104和6.3*104(图1)。而与阴性对照对比，有明显的荧光就可以用荧光检测，本研究以水为阴性对照，其荧光值约为2.2*104。因
此，进行如下的荧光定量检测。
[0029]实施例2 4
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磷酸赤藓糖的荧光定量检测
[0030]分别配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和1mM 4
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磷酸赤藓糖、3
‑
磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮分别与等体积的10mM 3,5
‑
二氨基苯甲酸(溶于5M磷酸)于100℃反应15min，冰上孵育10min，然后取80μL于黑色96孔平板中，多功能微孔板检测仪于激发光360/40n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.4
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磷酸赤藓糖的检测方法，其特征在于，所述方法包括使4
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磷酸赤藓糖与衍生剂反应的步骤，所述衍生剂选自3,5
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二氨基苯甲酸和3
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氨基苯甲酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4
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磷酸赤藓糖与衍生剂的浓度比为1:10。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使4
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磷酸赤藓糖与衍生剂反应的步骤包括使4
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磷酸赤藓糖与衍生剂在80
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100℃反应20
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30min的步骤。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括4

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠敏，安向向，张文娟，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：