本发明专利技术涉及双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，包括以下步骤：（1）2mDNA1沉默表达载体构建，包括获取粉虱基因靶标片段，所述靶标片段bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切后连接，获得二者连接产物；制备重组沉默表达载体后获得含沉默表达载体的农杆菌；（2）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系构建，包括获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株；饲养粉虱；获得具有沉默表达载体的粉虱；（3）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播，本方法将载体2mDNA1通过烟粉虱进行VIGS效果的水平传播，通过少批量栽种VIGS番茄苗而达到防治粉虱类昆虫的田间应用。到防治粉虱类昆虫的田间应用。到防治粉虱类昆虫的田间应用。
【技术实现步骤摘要】
双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建
[0001]本专利技术涉及农业昆虫与害虫防治，具体是涉及双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建。
技术介绍
[0002]粉虱，属半翅目粉虱科，主要种类有烟粉虱、柑桔粉虱和温室白粉虱等。在世界范围内广泛分布，其危害作物的方式为：
①
群集于叶背并通过其针状的刺吸式口器刺入植物的组织吸取叶片汁液，同时分泌大量蜜露诱发煤污病，影响植物的光合作用，影响植物的生长；
②
传播病毒，粉虱可传播的病毒达上百种，使植物染病减产。目前粉虱类昆虫的防治仍然以化学防治为主，由此带来的抗药性和环境污染等问题十分突出，而且该类昆虫危害植物部位为叶片背面，加大了触杀性药剂防治的难度。
[0003]随着技术研究手段的不断提高，分子生物学技术在病虫害防治的作用逐步提高，提升病虫害防治能力和水平同时，能够克服传统防治方法的弊端。病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)是干扰基因表达的一种简单而有效的方法。VIGS也已成功应用于昆虫基因沉默，比如说TRV载体已被用于沉默鳞翅目草食动物棉铃虫细胞色素P450基因，以及从烟粉虱(Bemisia tabaci)的cypB、hsp70。VIGS载体用于昆虫基因功能研究进行害虫防治的案例很多，但目前还未有关于VIGS效果传播的研究。
[0004]由于烟粉虱传播的双生病毒侵染范围广泛，因此成为基因沉默载体的研究热点，2mDNA1沉默载体是双生病毒TBCSV的DNA1组分，是由烟粉虱传双生病毒卫星分子改造而来的载体，该病毒对番茄可系统侵染，在韧皮部特异表达，可以在植物中产生有效的基因沉默，在应用于植物介导的烟粉虱基因沉默时有其独特的优势，然而目前能否应用2mDNA1沉默载体来沉默粉虱基因，并且粉虱能否传播VIGS效果，从而实现对粉虱的防治作用尚不清楚。
技术实现思路
[0005]为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术的目的提出双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建方法，将VIGS载体2mDNA1通过粉虱进行VIGS效果的水平传播，避免农杆菌注射法获取大量VIGS番茄时需要大批量培养相关菌株的麻烦与转基因育种时间和金钱成本，提供通过少批量栽种处理过的VIGS番茄苗而达到防治粉虱类昆虫的田间应用方法。
[0006]本方案的目的是通过以下技术方案实现的，双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，其技术要点为：包括以下步骤：（1）2mDNA1沉默表达载体构建
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段BtbioB的PCR纯化产物
②ꢀ
所述靶靶标片段bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB片段、2mDNA1载体片段；
③
所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1
‑
bioB连接产物；
④ꢀ
所述2mDNA1
‑
bioB连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1
‑
bioB重组沉默表达载体，浓度调整为30
‑
40 ng/μL；
⑤ꢀ
所述2mDNA1
‑
bioB重组沉默表达载体电击转化EHA105农杆菌感受态细胞；获得含2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的农杆菌（2）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系构建
①ꢀ
所述含2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的农杆菌按照农杆菌侵染法接种健康植株后，通过2mDNA1特异性检测，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株；
②ꢀ
在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱；获得具有2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的粉虱，所述基因沉默的粉虱生物素合成基因bioB表达被抑制，所述基因沉默的粉虱生物素含量降低。
[0007]（3） 2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播所述具有2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的粉虱接种健康植株，使健康植株获得了2mDNA1沉默载体，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株，所述携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株用于粉虱的防治。
[0008]进一步的，所述双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建适用于烟粉虱、温室白粉虱。
[0009]进一步的，所述粉虱基因靶标片段BtbioB具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段BtbioB获取的方法为：以粉虱cDNA为模板，用引入了BamHI和XbaI两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述BamHI和XbaI两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物为p
‑
bioB
‑
F和p
‑
bioB
‑
R，所述p
‑
bioB
‑
F具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述p
‑
bioB
‑
R具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；所述靶标基因片段长度为100
‑
1000 bp，测序验证后用Promega公司的纯化试剂盒纯化，获得靶标片段bioB的PCR纯化产物。
[0010]进一步的，所述靶标片段bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体双酶切均采用Takara 公司的QuickCut限制性内切酶试剂盒；反应条件均为：30℃，1hour；37℃，1hour；70℃，10min使酶失活。
[0011]进一步的，所述含有BamHI和XbaI粘性末端的bioB靶标基因片段和2mDNA1载体片段连接采用T4 DNA Ligase试剂盒，把靶标基因bioB片段：2mDNA1载体片段体积比为6.5 μL：1.5 μL，混匀后4℃过夜连接，获得2mDNA1
‑
bioB连接产物。
[0012]进一步的，所述2mDNA1特异性检测的引物为DNA1F和DNA1R ，所述DNA1F具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述DNA1R具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
[0013]进一步的，所述步骤（2）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系构建中，所述粉虱为烟粉虱，所述VIGS植株为VIGS番茄植株；所述在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱的方法为：取羽化1d的烟粉虱，在VIGS番茄植株上饲喂3
‑
5 d，获得2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的烟粉虱。
[0014]进一步的，所述步骤（3）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播中，所述粉虱
为烟粉虱，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，其特征为：包括以下步骤：（1）2mDNA1沉默表达载体构建
①ꢀ
获取粉虱基因靶标片段BtbioB的PCR纯化产物
②ꢀ
所述靶标片段bioB的PCR纯化产物、2mDNA1载体分别进行双酶切，获得含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB片段、2mDNA1载体片段；
③
所述含有BamHI和XbaI两个粘性末端的靶标基因bioB片段与2mDNA1载体片段连接，获得2mDNA1
‑
bioB连接产物；
④ꢀ
所述2mDNA1
‑
bioB连接产物热击转化克隆菌株大肠杆菌DH5α；热击处理后进行2mDNA1特异性检测，获得2mDNA1
‑
bioB重组沉默表达载体，浓度调整为30
‑
40 ng/μL；
⑤ꢀ
所述2mDNA1
‑
bioB重组沉默表达载体电击转化EHA105农杆菌感受态细胞；获得含2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的农杆菌；（2）2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系构建
①ꢀ
所述含2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的农杆菌接种健康植株后，通过2mDNA1特异性检测，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株；
②ꢀ
在携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株上饲养粉虱；获得具有2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的粉虱，所述具有2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的粉虱生物素合成基因bioB表达被抑制，生物素含量降低；（3） 2mDNA1介导的粉虱基因沉默体系的水平传播所述具有2mDNA1
‑
bioB沉默表达载体的粉虱接种健康植株，使健康植株获得了2mDNA1沉默载体，获得携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株，所述携带2mDNA1沉默载体的VIGS植株用于粉虱的防治。2.根据权利要求1所述的双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，其特征为：所述双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建适用于烟粉虱、温室白粉虱。3.根据权利要求1所述的双生病毒DNA1分子诱导的粉虱基因沉默体系的构建，其特征为：所述粉虱基因靶标片段BtbioB具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述粉虱基因靶标片段BtbioB获取的方法为：以粉虱cDNA为模板，用引入了BamHI和XbaI两个内切酶酶切位点靶标基因片段引物，扩增目的基因有效片段；所述BamHI和XbaI...
【专利技术属性】
技术研发人员：栾军波，黄艳贞，周雪平，王天玉，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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