本发明专利技术公开了一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，包括以下步骤：(1)选取脱脂生牛乳；(2)构建胃消化参数，经胃消化处理，得胃消化液；(3)构建肠消化参数，经肠消化处理，得肠消化液；(4)将肠消化液离心，取上清液，得可溶性消化产物；(5)将可溶性消化产物进行预处理；(6)将产物渗透压调至等渗，除菌；(7)用于肠道细胞培养。本发明专利技术通过模拟Wistar大鼠的胃肠效果环境，使液态乳的体外消化终点更加接近Wistar大鼠的体内消化结果，提高体外消化的可靠性和真实性；使可液态乳消化产物能够用于体外肠道细胞培养，用以开展各类生物评价试验。以开展各类生物评价试验。
【技术实现步骤摘要】
一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法
[0001]本专利技术属于食品消化与细胞生物学
，具体涉及一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法。
技术介绍
[0002]液态乳中含有各种基础营养及功能活性物质，同时还可能含有致敏原、农/药残等物质。要了解或评价液态乳中各组分对人体的营养价值、生理学作用以及卫生安全风险，除了采用一般的化学测定，也要采用“生物消化+生物评价”的方法。动物模型和人体临床试验成本高、操作复杂，受环境干扰大，且伴随有伦理(动物福利)问题。体外模拟消化作为上述过程的一种简易替代方法，已经被研究者广泛使用，但不同试验对真实的胃肠消化模拟程度存在差异，降低了试验结果的重复性和参照性。
[0003]M.Minekus等人(Food&Function，2014，5：1113
‑
1124)建立了一套基于“国际共识”的食品体外消化体系，Andr
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Brodkorb等人(Nature Protocols，2019，14：991
‑
1014)对此体系又进行了更新升级。但由于食品状态、质构和受试对象的不同会显著影响消化进程，该体系中相关消化参数(pH、时间、酶量等)的取值主要是对现有数据的平均化或一般化，准确度有限。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，该方法利用液态乳以及Wistar大鼠精细调整体外的消化参数，可以达到更好的消化模拟效果。此外，在液态乳的消化阶段后增加合适且有效的胰酶消除步骤，使消化产物能够继续用于肠道细胞培养。
[0005]本专利技术的上述目的可以通过如下技术方案来实现：一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，包括以下步骤：
[0006](1)选取脱脂生牛乳作为液态乳；
[0007](2)模拟胃消化
[0008]建立不同年龄段Wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化pH值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比；
[0009]配制胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液；
[0010]胃消化处理：选取步骤(1)中的脱脂生牛乳，将其酸度调至指定胃消化pH值，再加入胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液至指定胃消化酶/底物质量比，混匀，消化至指定胃消化时间，冷却，得胃消化液，备用；
[0011](3)模拟肠消化
[0012]建立不同年龄段Wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化pH值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比；
[0013]配制肠消化缓冲液和胰酶母液；
[0014]肠消化处理：将步骤(2)制备的胃消化液调至指定肠消化pH值，再加入肠消化缓冲液和胰酶母液至指定肠消化酶/底物质量比，混匀，消化至肠消化指定时间，冷却，得肠消化液，备用；
[0015](4)将步骤(3)中的肠消化液离心，取上清液，得可溶性消化产物；
[0016](5)将步骤(4)的可溶性消化产物进行预处理，以去除或失活胰酶；
[0017](6)将步骤(5)预处理后的可溶性消化产物的渗透压调至等渗，然后除菌，得液态乳消化液；
[0018](7)将步骤(6)中的液态乳消化液用于后续肠道细胞培养。
[0019]本专利技术根据具体的研究材料(本专利技术的液态乳)以及具体的受试动物(本专利技术中的Wistar大鼠)而精细调整体外的消化参数，具有更好的消化模拟效果，这是本专利技术的创新点之一。此外，还需要根据实验者的研究目的，在液态乳的消化阶段后增加合适且有效的胰酶消除步骤，使消化产物能够继续用于肠道细胞培养，这是本技术的另外一个创新点。本专利技术的方法可为液态乳的体外生物学评价提供方法学支持，作为体内研究的替代试验或预备试验，改善动物福利、降低试验成本开销。
[0020]在上述模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化的方法中：
[0021]优选的，步骤(1)中脱脂生牛乳可以是直接购买脱脂生牛乳，也可以是购买新鲜牛乳，然后通过离心进行脱脂处理。
[0022]作为本专利技术一种优选的实施方式，步骤(1)中液态乳的脱脂处理包括：采用新鲜生牛乳作为液态乳材料，经8000g 4℃离心10分钟(重复2次)，用医用棉签刮去上层乳脂，得脱脂生牛乳。
[0023]优选的，步骤(2)所述Wistar大鼠为SPF级雄性大鼠。
[0024]优选的，步骤(2)中建立不同年龄段Wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化pH值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比，其中胃消化酶是指胃蛋白酶，底物为生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：A.模拟幼年Wistar大鼠，1～2周龄，pH＝3.9，时间2.0～2.5小时，胃消化酶/底物质量比1∶120～180；B.模拟成年Wistar大鼠，6～8周龄，pH＝2.8，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶80～100；C.模拟老年Wistar大鼠，20～22周龄，pH＝3.0，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶85～100。
[0025]本专利技术中底物是指牛乳蛋白，即生牛乳中蛋白含量。
[0026]优选的，步骤(2)中胃消化缓冲液的用量为生牛乳总体积的0.5～1倍。
[0027]作为本专利技术一种优选的实施方式，步骤(2)中胃消化缓冲液主要含有KCl6.9mM、KH2PO40.9mM、NaHCO325mM、NaCl47.2mM、MgCl20.1mM、(NH4)2CO30.5mM、CaCl20.15mM，酸碱度调至指定胃消化pH值。
[0028]优选的，步骤(2)中胃蛋白酶母液采用胃消化缓冲液溶解胃蛋白酶配制获得。
[0029]作为本专利技术一种优选的实施方式，配制胃蛋白酶母液时：使用胃消化缓冲液溶解胃蛋白酶(美国Sigma公司，货号P6887)，现配现用。
[0030]优选的，步骤(2)中混匀为37℃恒温水浴摇晃混匀，转速为100～150rpm，冷却为采用冰水中冷却。
[0031]作为作为本专利技术一种优选的实施方式，胃消化步骤包括：用玻璃锥形瓶承装牛乳，
用1N盐酸将牛乳酸度调至指定pH(滴加，晃匀)，加入生牛乳0.5～1倍体积的胃消化缓冲液，加入胃蛋白酶母液至指定的胃消化酶(胃蛋白酶)/底物(牛乳蛋白)质量比(晃匀)，37℃恒温水浴摇晃(100～150rpm转速)，消化指定时间后，取出锥形瓶置于冰水中冷却，得到胃消化液产物，备用。
[0032]优选的，步骤(3)所述Wistar大鼠为SPF级雄性大鼠。
[0033]优选的，步骤(3)中建立不同年龄段Wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化pH值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比，其中肠消化酶是指胰酶，底物是指生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：A.模拟幼年Wistar大鼠，1～2周龄，pH＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50；B.模拟成年Wistar大鼠，6～8周龄，pH＝7.0，时间1.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，其特征是包括以下步骤：(1)选取脱脂生牛乳作为液态乳；(2)模拟胃消化建立不同年龄段Wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化pH值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比；配制胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液；胃消化处理：选取步骤(1)中的脱脂生牛乳，将其酸度调至指定胃消化pH值，再加入胃消化缓冲液和胃蛋白酶母液至指定胃消化酶/底物质量比，混匀，消化至指定胃消化时间，冷却，得胃消化液，备用；(3)模拟肠消化建立不同年龄段Wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化pH值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比；配制肠消化缓冲液和胰酶母液；肠消化处理：将步骤(2)制备的胃消化液调至指定肠消化pH值，再加入肠消化缓冲液和胰酶母液至指定肠消化酶/底物质量比，混匀，消化至肠消化指定时间，冷却，得肠消化液，备用；(4)将步骤(3)中的肠消化液离心，取上清液，得可溶性消化产物；(5)将步骤(4)的可溶性消化产物进行预处理，以去除或失活胰酶；(6)将步骤(5)预处理后的可溶性消化产物的渗透压调至等渗，然后除菌，得液态乳消化液；(7)将步骤(6)中的液态乳消化液用于后续肠道细胞培养。2.根据权利要求1所述模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，其特征是：步骤(2)中建立不同年龄段Wistar大鼠的胃消化参数，包括指定胃消化pH值、酶解时间、胃消化酶/底物质量比，其中胃消化酶是指胃蛋白酶，底物为生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：A.模拟幼年Wistar大鼠，1～2周龄，pH＝3.9，时间2.0～2.5小时，胃消化酶/底物质量比1∶120～180；B.模拟成年Wistar大鼠，6～8周龄，pH＝2.8，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶80～100；C.模拟老年Wistar大鼠，20～22周龄，pH＝3.0，时间2.0小时，胃消化酶/底物质量比1∶85～100。3.根据权利要求1所述模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，其特征是：步骤(3)中建立不同年龄段Wistar大鼠的肠消化参数，包括指定肠消化pH值、酶解时间、肠消化酶/底物质量比，其中肠消化酶是指胰酶，底物是指生牛乳中牛乳蛋白，根据不同年龄段分为：A.模拟幼年Wistar大鼠，1～2周龄，pH＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50；B.模拟成年Wistar大鼠，6～8周龄，pH＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50；C.模拟老年Wistar大鼠，20～22周龄，pH＝7.0，时间1.5～2.0小时，肠消化酶/底物质量比1∶50。4.根据权利要求1所述模拟大鼠胃肠环境的液态乳体外静态消化及肠道细胞培养的方法，其特征是：步骤(2)～步骤(3)中所述Wistar大鼠为SPF级雄性大鼠；步骤(2)中～步...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨怀谷，王旭苹，程镜蓉，林耀盛，邹金浩，唐道邦，刘学铭，
申请(专利权)人：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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