产生心脏组织模拟物的方法技术

本发明专利技术涉及一种产生心脏组织模拟物的方法，其包括以下步骤：将心肌细胞(CM)和成纤维细胞(FB)按2.5：1至10：1的比例混合，从而提供第一混合物，培养所述第一混合物，使得所述心肌细胞和所述成纤维细胞形成球形结构，按1.5：1至4：1的心肌细胞(CM)与内皮细胞(EC)的比例向所述球形结构添加内皮细胞(EC)，从而提供第二混合物，及培养所述第二混合物，从而形成心脏组织模拟物。本发明专利技术进一步涉及一种心脏组织模拟物，其包括心肌细胞(CM)、内皮细胞(EC)和成纤维细胞(FB)，其中所述心脏组织模拟物包括肌节结构和血管结构。本发明专利技术的进一步方面是所述心脏组织模拟物用于心脏组织修复或置换的方法和使用心脏组织模拟物筛选化合物的方法。方法和使用心脏组织模拟物筛选化合物的方法。方法和使用心脏组织模拟物筛选化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生心脏组织模拟物的方法


[0001]本专利技术涉及一种产生心脏组织模拟物的方法、一种心脏组织模拟物和所述心脏组织模拟物用于心脏组织修复或心脏组织置换的方法中。

技术介绍

[0002]心脏组织工程使得有可能创造出治疗性组织替代品用于修复患病的原生心肌，并作为药物测试的人种的非动物替代物。心脏组织模拟物可以充当单一培养物2D系统的直接替代物，作为药物测试和验证的更精确的环境。从长远来看，这种组织模拟物可以充当自体组织来源，用于更换和修复受损的心脏组织。
[0003]然而，目前可用的组织模型和组织模拟物无法在分子、生化和生理水平上准确模拟人类心肌对应激刺激的反应。
[0004]基于上述现有技术，本专利技术的目的是提供手段和方法以提供更接近地像原生心肌组织的组织模拟物，特别是在其模拟应激反应的能力方面。该目的通过本说明书的独立权利要求的主题来实现。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一方面涉及一种用于产生心脏组织模拟物的方法，其包括以下步骤
[0006]a.提供心肌细胞，
[0007]b.提供成纤维细胞，
[0008]c.按2.5：1至10：1的比例混合所述心肌细胞和所述成纤维细胞，从而提供第一混合物，
[0009]d.培养所述第一混合物，使得心肌细胞和成纤维细胞形成球形结构，
[0010]e.将内皮细胞按1.5：1至4：1的比例添加到所述球形结构中，从而提供第二混合物，
[0011]f.培养所述第二混合物，从而形成心脏组织模拟物。/>[0012]本专利技术的第二方面涉及一种心脏组织模拟物，其包括心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞，其中所述心脏组织模拟物包括肌节结构，并且其中所述心脏组织模拟物包括血管结构。
[0013]本专利技术的第三方面涉及根据本专利技术第二方面的心脏组织模拟物用于心脏组织修复或心脏组织置换的方法中。
[0014]本专利技术的第四方面涉及使用根据本专利技术第二方面的心脏组织模拟物筛选化合物的方法，其中将所述心脏组织模拟物暴露于所述化合物，并且其中测量所述心脏组织模拟物的生长、收缩频率、收缩幅度、耗氧率、血管芽的平均长度和/或血管分支点的数量以确定所述化合物对心脏组织模拟物的影响。
[0015]有利地，所述方法能够产生心脏组织模拟物，其在分子、生化和生理水平模拟原生心脏组织的应激反应。这些可应用于治疗心脏病或筛选化合物。
[0016]附图简要说明
[0017]图1显示根据本专利技术的方法来使用人类细胞获得心脏组织模拟物的实施例的示意图；
[0018]图2显示通过根据本专利技术的方法获得的心脏组织模拟物的显微图像；
[0019]图3显示根据本专利技术的方法来使用大鼠细胞获得心脏组织模拟物的另一个实施例的示意图；
[0020]图4显示根据本专利技术的心脏组织模拟物的大小测量结果；
[0021]图5显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物(CTM)的显微图片和大小测量结果；
[0022]图6显示与对照组织模拟物相比在苯肾上腺素(PE)处理过的心脏组织模拟物中肌联蛋白(Titin)N2B和N2BA2的mRNA表达；
[0023]图7显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的显微免疫荧光图像；
[0024]图8显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的起搏(pacing)实验结果；
[0025]图9显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的耗氧率；
[0026]图10显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的耗氧率；
[0027]图11显示与对照组织模拟物相比用苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的细胞外酸化率；
[0028]图12显示心脏组织模拟物在经过和未经苯肾上腺素(PE)处理下用Atp5a1和鬼笔环肽染色的显微图像；
[0029]图13显示荧光显微图像，其示出经过和未经苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物的血管芽生(sprouting)；
[0030]图14显示经过和未经苯肾上腺素(PE)处理的心脏组织模拟物中的芽长度、血管分支点和芽厚度的测量结果；
[0031]图15显示用人脐静脉内皮细胞进行的球状体测定的结果；
[0032]图16是用于说明苯肾上腺素(PE)刺激心肌细胞的假设的示意图；
[0033]图17+18显示进一步的基于HUVEC球状体的芽生式血管生成测定的结果，该测定由VEGF或用苯肾上腺素(PE)诱导的新生大鼠心肌细胞的细胞培养物上清液刺激；
[0034]图19显示芽长度测量结果和心脏组织模拟物的显微图像，以评估血管内皮生长因子的作用；
[0035]图20显示在苯肾上腺素(PE)的存在下使用和未使用β
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受体阻滞剂(β
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blocker)培养的心脏组织模拟物的收缩频率；
[0036]图21显示在苯肾上腺素(PE)的存在下使用和未使用β
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受体阻滞剂培养的包括GFP标记的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的心脏组织模拟物的显微图片；
[0037]图22显示在苯肾上腺素(PE)的存在下使用和未使用β
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受体阻滞剂培养的心脏组织模拟物中的GFP标记的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管长度测量结果；
[0038]图23显示在苯肾上腺素(PE)或β
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受体阻滞剂的存在下形成管的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的显微图像；
[0039]图24显示在苯肾上腺素(PE)或β
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受体阻滞剂的存在下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管长度测量结果；
[0040]图25显示在新生大鼠心肌细胞的培养物上清液的存在和缺乏下培养的人脐静脉内皮细胞球状体的芽长度测量结果；
[0041]图26显示用TGFβ2或在缺氧条件下培养的带有GFP标记的HUVEC的CTM的显微图像；
[0042]图27显示用TGFβ2或在缺氧条件下培养的CTM的芽长度测量结果；
[0043]图28显示在TGFβ2的存在或缺乏下培养的带有染色的波形蛋白的CTM的显微图像；
[0044]图29显示用TGFβ2或在缺氧条件下培养的CTM的显微图像，其中使用了二次谐波生成来使大的和高度结构化的分子可视；
[0045]图30显示来自用TGFβ2或在缺氧条件下培养的CTM培养物的被天狼星红染色的CTM切片的显微图像；
[0046]图31显示如图30中所示的天狼星红染色结果的量化；
[0047]图32显示使用赫斯特(Hoechst)3342、同工凝集素(Isolectin)B4和波形蛋白染色的TGFβ2处理的CTM的显微图像；
[0048]图33显示使用得自根据本专利技术的CTM的mRNA的cDNA的qPCR结果；
[0049]图34显示使用DAP、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生心脏组织模拟物的方法，其包括以下步骤：a.提供心肌细胞(CM)；b.提供成纤维细胞(FB)；c.将所述心肌细胞(CM)和所述成纤维细胞(FB)按2.5：1至10：1的比例混合，从而提供第一混合物；d.培养所述第一混合物，使得所述心肌细胞和所述成纤维细胞形成球形结构；e.按1.5：1至4：1的心肌细胞(CM)与内皮细胞(EC)的比例将内皮细胞(EC)添加到所述球形结构中，从而提供第二混合物；f.培养所述第二混合物，从而形成心脏组织模拟物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述心肌细胞(CM)和所述成纤维细胞(FB)按4：1至6：1、特别是5：1的心肌细胞(CM)与成纤维细胞(FB)的比例混合。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中将所述内皮细胞(EC)按1.5：1至3：1、特别是2：1的心肌细胞(CM)与内皮细胞(EC)的比例添加到所述球形结构中。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述球形结构包括50μm至1mm、更特别是100μm至500μm、最特别是200μm至300μm的直径。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述球形结构表现出收缩能力，其特征在于每分钟至少10次跳动和/或至少7μm的收缩幅度，特别是当电起搏时，更特别是在起搏频率为1Hz且起搏电压为15V下。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心脏组织模拟物包括肌节结构，其特别地特征在于平均肌节长度为至少2μm。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心脏组织模拟物包括血管结构，其特别地特征在于平均长度为至少200μm。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心肌细胞(CM)、所述成纤维细胞(FB)和/或所述内皮细胞(EC)是人细胞或动物细胞、特别是大鼠细胞。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述心肌细胞(CM)和/或所述内皮细胞(EC)是从干细胞、特别是诱导多能干细胞(iPS)、更特别是人诱导多能干细胞(hiPS)分化而来。10.一种心脏组织模拟物，其特别是通过根据权利要求1至9中任一项所述的方法获得的，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾亚，
申请(专利权)人：基因组生物制品UG有限责任公司，
类型：发明
国别省市：