一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，包括以下步骤：(1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；(2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；(3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞。本发明专利技术将猪IL
【技术实现步骤摘要】
一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法
[0001]本专利技术涉及构建表达细胞因子的饲养层细胞的方法，尤其是构建高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞的方法，属于生物领域。
技术背景
[0002]外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是指血液中具有环形核的细胞总称。PBMCs包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。其中，淋巴细胞又包括T细胞、B细胞和NK细胞。在外周血免疫细胞生长发育和成熟过程中，除了需要抗原刺激之外，细胞因子在促进和调节免疫系统的功能方面发挥着不可替代的作用。例如，初始辅助性T细胞(Th0)分化时，不同细胞因子决定其不同的命运：在细胞因子IL
‑
4作用下Th0能分化为Th1，在细胞因子IFN
‑
γ作用下Th0能分化为Th2。Th1细胞的进一步分化需要许多其他的的细胞因子参与，包括IL
‑
2、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM
‑
CSF)和IFN
‑
γ等。而Th2细胞通过分泌IL
‑
4和IL
‑
6等促进B细胞的成熟。IFN
‑
α和IFN
‑
γ能促进自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)增殖和分化。这表明，在外周血免疫细胞分化、发育和成熟过程中，IL
‑
2和IL
‑
4处于细胞因子网络的中心。
[0003]目前国内外已经有成功应用饲养细胞的例子。例如经典的L929为小鼠成纤维细胞，由于其细胞培养上清中表达较高的小鼠巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M
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CSF)，因而常被用来纯化细胞因子M
‑
CSF或直接用于诱导骨髓来源的巨噬细胞。L929细胞培养上清诱导骨髓来源的巨噬细胞，与商品化的M
‑
CSF诱导骨髓来源的巨噬细胞具有几乎相同的效果，极大地降低了培养成本。
[0004]目前关于猪的细胞因子如IL
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2、IL
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4和IFN
‑
α国外仅有少数生物公司生产，国内几乎没有相关商品化的细胞因子。并且，由于猪的细胞因子相对应用较少，其商品化受到了较大的限制，其价格也较为昂贵。因此，快速构建表达这些细胞因子的饲养层细胞，是利用这些冷门细胞因子进行猪外周血单个核细胞体外扩增培养的经济快捷的技术方法。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是快速构建稳定高表达猪细胞因子IL
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2、IL
‑
4和IFN
‑
α的饲养层细胞，特点是快速、低成本、操作简单，可用于猪PBMCs的培养。
[0006]为了实现该目的，本专利技术构建了表达IL
‑
2、IL
‑
4和IFN
‑
α的表达载体，并且将该载体转染到细胞系内，利用抗性基因筛选稳定表达这些细胞因子的细胞系。具体步骤如下：
[0007](1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；
[0008](2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；
[0009](3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞，
[0010]所述细胞因子为IL
‑
2或IL
‑
4或IFN
‑
α。
[0011]优选地，所述同源臂引物的序列如下：
[0012]猪IL
‑
2F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGTATAAGATGCAGCTCTTG
[0013]猪IL
‑
2R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAAGTCAGTGTTGAGTAGATG
[0014]猪IL
‑
4F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGGGTCTCACCTCCCAACTG
[0015]猪IL
‑
4R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAACACTTTGAGTATTTCTC
[0016]猪IFN
‑
α4F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGGCCCCAACCTCAGCC
[0017]猪IFN
‑
α4R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCACTCCTTCTTCCTGAATC。
[0018]优选地，所述慢病毒载体为pHKO
‑
EF1a，该质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0019]优选地，所述包装慢病毒的细胞为293T细胞。
[0020]优选地，所述辅助质粒为psPAX2和pMD2.G。
[0021]优选地，所述重组质粒与辅助质粒psPAX2、pMD2.G的用量分别为2ug、2ug、1ug。
[0022]优选地，所述重组质粒与辅助质粒的总量与阳离子转染试剂的比例为1：1～4(μg：μl)。
[0023]优选地，所述饲养层细胞为猪肾细胞PK
‑
15。
[0024]更为具体的步骤如下：
[0025](1)根据NCBI公布的猪(Sus scrofa，ss)IL
‑
2、IL
‑
4和IFN
‑
α序列，设计对应的引物；
[0026](2)分别克隆猪IL
‑
2(465bp)、IL
‑
4(402bp)和IFN
‑
α(570bp，IFN
‑
alpha
‑
4)的编码序列，并进行测序验证；
[0027](3)将猪IL
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2、IL
‑
4和IFN
‑
α连接到表达载体，本专利技术使用慢病毒载体pHKO
‑
EF1a；
[0028](4)表达载体大量扩增并纯化之后，同辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装病毒，实验发现最优转染慢病毒质粒pHKO和辅助质粒psPAX2、pMD2.G最优用量为2ug、2ug、1ug。收集转染后24h和48h细胞上清，包装的病毒分别命名为lenti
‑
ssIL
‑
2、lenti
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ssIL
‑
4和lenti
‑
ssIFN
‑
α4；...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)从猪的外周血单个核细胞中克隆细胞因子，设计同源臂引物并连接慢病毒载体，构建含有细胞因子的重组质粒；(2)使用转染的方式，利用阳离子转染试剂，将构建的重组质粒同辅助质粒共转染包装慢病毒的细胞；(3)用包装的慢病毒感染饲养层细胞，所述细胞因子为IL
‑
2或IL
‑
4或IFN
‑
α。2.如权利要求1所述高表达猪PBMCs细胞因子的饲养层细胞构建方法，其特征在于，所述同源臂引物的序列如下：猪IL
‑
2F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGTATAAGATGCAGCTCTTG猪IL
‑
2R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAAGTCAGTGTTGAGTAGATG猪IL
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4F同源臂引物：gaacacaggaccggttctagaATGGGTCTCACCTCCCAACTG猪IL
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4R同源臂引物：gaagtttgttgcgccggatccTCAACACTTTGAGTATTTCTC猪IFN
‑
α4F...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔旻，王珂，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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