具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、重组基因、重组载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，将目标植物的谷氨酰胺合成酶中与水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列的第311位对应的精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种。本发明专利技术还提供了编码该谷氨酰胺合成酶突变体的重组基因、重组载体和重组工程菌及其应用。本发明专利技术提供的突变体可以提高多种植物对草铵膦的抗性，同时保持自身的生物酶催化活性，可应用于抗草铵膦植物品种的培育。可应用于抗草铵膦植物品种的培育。可应用于抗草铵膦植物品种的培育。

【技术实现步骤摘要】
具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、重组基因、重组载体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是植物氮代谢的关键酶，催化谷氨酸与NH4
+
合成谷氨酰胺，把无机氮转化为有机氮。谷氨酰胺合成酶一种定位为细胞质内，称为胞质型GS(GS1)；还有一种定位于叶绿体(或质体)内称为质体型GS(GS2)。
[0003]草铵膦(Glufosinate ammonium，商品名称保试达Basta)，由赫斯特公司80年代开发成功(后归属于拜耳公司)，属广谱触杀型除草剂，内吸作用不强。其有效成分为phosphinothricin(简称PPT)，化学名称为(RS)
‑2‑
氨基
‑4‑
(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。谷氨酰胺合成酶是草铵膦的靶标蛋白，草铵膦通过与底物谷氨酸的竞争，先与ATP结合，磷酸化的PPT占据谷氨酰胺合成酶反应中心，造成谷氨酰胺合成受到抑制，一方面使得细胞氮代谢紊乱，另一方面还会在细胞内造成NH
4+
的积累，质体型谷氨酰胺合成酶参与过量铵的同化会在细胞中产生大量质子，降低pH，导致细胞酸度增加，造成酸胁迫，致使植物死亡，达到除草效果。
[0004]现在培育抗草铵膦品种的主要方法是通过转基因方法，把细菌来源的抗草铵膦基因导入农作物中，获得转基因抗草铵膦作物新品种。目前主要应用的抗草铵膦基因来源于细菌的Pat基因和Bar基因，这两个基因都可以编码草铵膦乙酰化酶，该酶可以使PPT乙酰化,乙酰化的产物无抑制谷氨酰胺合成酶的活性。
[0005]转基因作物在全世界的接受程度仍然比较较低，Pat和Bar转基因作物仍有一定的缺点,另外随着基因编辑技术的快速发展，使得各种除草剂靶标基因的编辑成为可能，且基因编辑作物较转基因作物更易被人们接受，因此，寻找耐受各种除草剂靶标基因的突变体成为当务之急，基于此，提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术的缺陷和市场需求，本专利技术提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用的方法，该谷氨酰胺合成酶突变体可以赋予植株草铵膦抗性，在农作物转化该谷氨酰胺合成酶突变体，植物可以正常的生长和发育。
[0007]一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，将目标植物的谷氨酰胺合成酶中与水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列的第311位对应的精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种。
[0008]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
[0009]优选地，所述谷氨酰胺合成酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
[0010]在根据本专利技术的一个实施方案中，所述目标植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、谷子、荞麦、棉花、大豆、花生、蚕豆、绿豆、豌豆、菜豆、豇豆、扁豆、苜蓿、向日葵、油菜、萝卜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、洋葱、胡萝卜、芹菜、甘薯、马铃薯、甜菜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、菠菜、茼蒿、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、苦瓜、丝瓜、西瓜、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草中的任一种。
[0011]本专利技术还提供了一种用于编码上述的谷氨酰胺合成酶突变体的重组基因，目标植物编码谷氨酰胺合成酶的基因中用于编码对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列第311位的精氨酸(R)的密码子突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种氨基酸的密码子。
[0012]在根据本专利技术的一个实施方案中，目标植物编码野生型谷氨酰胺合成酶的基因序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的任一种；
[0013]优选地，核苷酸序列突变位点的密码子突变选自表1中的任一种。
[0014]表1
[0015][0016]本专利技术进一步提供了一种重组载体或重组工程菌，包含上述的重组基因。所述重组载体的骨架质粒优选为PY16,由YCplac22(GenBank:X75455)改造而来，所述重组工程菌的宿主菌选自酿酒酵母。
[0017]本专利技术进一步提供了上述的谷氨酰胺合成酶突变体、重组基因或重组载体或重组工程菌在培育具有草铵膦抗性的植物突变体中的应用。
[0018]本专利技术的另一方面提供了一种具有草铵膦抗性的植物品种的制备方法，包括：通过同源重组或基因编辑技术使植物株基因组中谷氨酰胺合成酶的编码基因中对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列第311位的精氨酸(R)的密码子突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种氨基酸的密码子。
[0019]在根据本专利技术的一个实施方案中，还进一步包括通过有性杂交或无性培养扩繁获得批量种苗。
[0020]本专利技术最后还提供了一种具有草铵膦抗性的植物突变体，其特征在于，谷氨酰胺
合成酶中与水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列的第311位对应的精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种；优选地，所述植物突变体是通过上述的制备方法培育得到的。
[0021]本专利技术还进一步提供了具有草铵膦抗性的植物细胞、组织或外植体，其谷氨酰胺合成酶中与水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列的第311位对应的精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种。
[0022]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0023]本专利技术提供的突变体可以提高多种植物对草铵膦的抗性，同时保持自身的生物酶催化活性。转化了本专利技术提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长，该谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育外，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物，应用前景广泛。
附图说明
[0024]图1为水稻野生型GS与突变体的氨基酸序列比对图；
[0025]图2为水稻、玉米和油菜野生型GS氨基酸序列与对应突变体的氨基酸序列比对图；
[0026]图3为PY16酵母表达载体图；
[0027]图4为GS突变体酵母抗性验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，将目标植物的谷氨酰胺合成酶中与水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列的第311位对应的精氨酸(R)突变为丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(M)、天门冬氨酸(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)中的任一种。2.如权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1；优选地，所述谷氨酰胺合成酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:7。3.如权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述目标植物选自水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、高粱、谷子、荞麦、棉花、大豆、花生、蚕豆、绿豆、豌豆、菜豆、豇豆、扁豆、苜蓿、向日葵、油菜、萝卜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、洋葱、胡萝卜、芹菜、甘薯、马铃薯、甜菜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、韭菜、大葱、菠菜、茼蒿、芝麻、苋菜、莴苣、黄瓜、西葫芦、南瓜、苦瓜、丝瓜、西瓜、木薯、葡萄、草莓、冬瓜、烟草中的任一种。4.一种用于编码如权利要求1
‑
3中任一项所述的谷氨酰胺合成酶突变体的重组基因，其特征在于，目标植物编码谷氨酰胺合成酶的基因中用于编码对应于水稻野生型谷氨酰胺合成酶氨基酸序列第311位的精氨酸(R)的密码子突变为丙氨酸(A)、半胱氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴艳斌，吴业春，靳海霞，周玉娇，王金羽，
申请(专利权)人：科稷达隆北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：