一种转基因非人动物的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种转基因非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用，采用CRISPR/Cas9系统构建了肠道特异性表达NPC1L1

【技术实现步骤摘要】
一种转基因非人动物的构建方法及其应用


[0001]本申请涉及转基因非人动物的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种转基因非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]胆固醇是哺乳动物细胞膜的重要结构成分，在细胞信号转导、胞内转运、类固醇激素和胆汁酸的合成中起着重要作用。动脉粥样硬化性心血管疾病是一种在发达国家中主要的致死疾病，而临床和动物研究表明，高水平的血浆胆固醇是动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素。因此，如何调节胆固醇代谢引起了越来越多研究者的关注。
[0003]膳食胆固醇的过量摄入是导致高胆固醇血症的常见原因，对胆固醇吸收机制的认识可望为高胆固醇血症的防治提供新的思路。目前认为，胞外游离胆固醇的吸收主要是由尼曼
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匹克C1型样蛋白1(Niemann
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Pick C1
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Like 1,NPC1L1)介导的囊泡内吞(vesicular endocytosis)途径实现的。NPC1L1蛋白是一种N
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糖基化蛋白质，由1333个氨基酸和13个跨膜片段组成。它有一个可以选择性地结合胆固醇和氧固醇的典型的N端信号肽，以及一个带有对胆固醇内化必不可少的内吞信号序列的不太保守的C端细胞质尾部。这种蛋白质的表达模式是物种和组织特异性的。
[0004]NPC1L1高表达于小肠吸收型上皮细胞的刷状缘和人及灵长类动物的肝细胞胆管面。NPC1L1基因敲除小鼠对胆固醇的吸收率下降约70％，能够抵抗饮食诱导的高胆固醇血症；而其他脂类(如甘油三酯、磷脂)和植物性甾醇的吸收则不受影响。解析NPC1L1囊泡形成、内吞、运输和循环等相关过程的细胞分子机制，对揭示胆固醇的吸收机制具有重要意义。
[0005]寻找NPC1L1的共作用分子，是解析胆固醇吸收机制的有效策略。因包括大鼠在内的啮齿类动物肝脏组织几乎不表达NPC1L1蛋白，迄今关于NPC1L1介导胆固醇吸收机制的研究多以离体大鼠肝癌细胞为模型，导入人NPC1L1基因进行的。
[0006]由于包括小鼠和大鼠在内的啮齿类动物的肝脏组织很少表达NPC1L1蛋白，因此NPC1L1在胆固醇吸收中的机制的体外研究主要通过在大鼠肝癌细胞系中过表达人NPC1L1蛋白进行。虽然外源NPC1L1基因在一定程度上可以模拟该蛋白的功能，但与表达内源NPC1L1蛋白的细胞模型相比，由于表达水平不可控，在阐明信号通路方面存在明显局限性。
[0007]非专利文献《Flotillins play an essential role in Niemann
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Pick C1
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like 1
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mediated cholesterol uptake》利用NPC1L1
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EGFP在大鼠肝癌细胞过表达的细胞模型，经免疫沉淀和质谱分析，发现共作用分子Flotillin在介导形成富含胆固醇的NPC1L1微区(microdomain)膜结构和胆固醇吸收中发挥重要作用。然而，目前尚无可体内示踪NPC1L1的动物模型，用以进一步在体内探索NPC1L1在胆固醇吸收中的作用机制。
[0008]在NPC1L1蛋白的在体内功能研究方面，目前常用的小鼠模型为NPC1L1基因全身敲除模型，或者在全身敲除的基础上利用villin
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Cre使肠道过表达人源NPC1L1，或者利用载脂蛋白E启动子在肝脏过表达人源NPC1L1，以探讨肠道或肝脏NPC1L1蛋白在胆固醇代谢中
的作用。虽然敲入的外源NPC1L1在标靶组织的定位与内源性蛋白的定位基本一致，但是也会发生脱靶现象。现有文献报道的关于NPC1L1定位的研究，不管是在体内的小鼠组织还是离体的细胞模型，均利用荧光标记二抗杂交显影，这在放大荧光信号的同时也会产生杂信号。专利文献CN101580871A公开了使用报告基因并连接标签蛋白进行NPC1L1蛋白的定位，但其将标签蛋白插入编码NPC1L1蛋白的氨基酸之间，可能会影响NPC1L1蛋白的表达及功能，并且该专利文献采用的也是体外示踪的方法。

技术实现思路

[0009]本申请利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了肠道特异性表达NPC1L1
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FLAG
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EGFP融合蛋白的小鼠模型，在内源性NPC1L1蛋白的C端分别标记上增强型绿色荧光蛋白EGFP和FLAG蛋白标签。
[0010]本专利技术的第一方面，涉及一种转基因非人动物的构建方法，所述的构建方法包括在转基因非人动物的NPC1L1基因的3
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非编码区插入报告基因和/或编码标签蛋白的基因。
[0011]优选的，所述的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、人生长激素基因(hGH)、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、绿色荧光蛋白基因(GFP)、增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)、β
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半乳糖苷酶基因(β
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Gal)、TdTomato红色荧光蛋白基因(TdTomato：番茄串联二聚体)、mCherry红色荧光蛋白基因(mCherry)或萤火虫荧光素酶基因。进一步优选的，所述的报告基因为EGFP，所述的EGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
[0012]优选的，所述的标签蛋白包括但不限于Myc标签蛋白、FLAG标签蛋白、His6标签蛋白、T7标签蛋白、V5标签蛋白、HA标签蛋白或GST标签蛋白。进一步优选的，所述的标签蛋白为FLAG标签蛋白，所述的FLAG标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
[0013]优选的，所述的非人动物表达NPC1L1蛋白
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标签蛋白
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报告基因编码蛋白的融合蛋白。其中，NPC1L1蛋白与标签蛋白之间、标签蛋白与报告基因编码蛋白之间可以直接连接或通过接头连接。所述的接头可以为现有技术中常规的柔性接头、刚性接头、可裂解接头或无意义氨基酸等等。优选为连接肽。优选的，所述的连接肽序列如SEQ ID NO：30所示。
[0014]进一步优选的，所述的非人动物表达NPC1L1蛋白
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连接肽
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标签蛋白
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连接肽
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报告基因编码蛋白的融合蛋白。
[0015]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的非人动物表达NPC1L1
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FLAG
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EGFP(NPC1L1
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FG)蛋白或者NPC1L1
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连接肽
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FLAG
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连接肽
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EGFP蛋白。
[0016]优选的，所述的融合蛋白为肠道特异性表达蛋白。进一步优选的，所述的肠道为小肠，例如十二指肠、空肠或回肠。
[0017]优选的，插入位点为3
’
非编码区前(优选为紧邻3
’
非编码区之前)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括在转基因非人动物的NPC1L1基因的3
’
非编码区插入报告基因和/或编码标签蛋白的基因。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，插入位点位于NPC1L1蛋白阅读框末端和3'UTR之间，优选的，所述的插入位点位于NPC1L1蛋白阅读框末端与终止密码子之间。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物表达NPC1L1蛋白
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标签蛋白
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报告基因编码蛋白的融合蛋白，优选的，NPC1L1蛋白与标签蛋白之间、标签蛋白与报告基因编码蛋白之间使用连接肽连接，所述的连接肽序列如SEQ ID NO：30所示。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，报告基因选自CAT、hGH、SEAP、GFP、EGFP、β
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Gal、TdTomato、mCherry或萤火虫荧光素酶基因，优选的，所述的报告基因为EGFP，所述的EGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的标签蛋白选自Myc标签蛋白、FLAG标签蛋白、His6标签蛋白、T7标签蛋白、V5标签蛋白、HA标签蛋白或GST标签蛋白，优选的，所述的标签蛋白为FLAG标签蛋白，进一步优选的，所述的FLAG标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用sgRNA和/或打靶载体构建转基因非人动物，其中，所述的sgRNA靶位点序列如SEQ ID NO：13
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20任一项所示，优选的，所述的sg...

【专利技术属性】
技术研发人员：章卫平，陈玉霞，武晓静，林洁，师建辉，冯滢樱，史亚男，
申请(专利权)人：天津医科大学朱宪彝纪念医院天津医科大学代谢病医院，天津代谢病防治中心，
类型：发明
国别省市：