一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系及应用。该高效诱导体系，由继代培养基和处理培养基组成；所述的继代培养基通过以下方法配制：1L水中加入4.74g MS固体培养基和30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入8g琼脂粉和4.5uM 2,4

【技术实现步骤摘要】
一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系及应用


[0001]本专利技术属于梨基因工程技术体系领域，具体涉及一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系及应用。

技术介绍

[0002]梨是蔷薇科(Rosaceae)桃亚科(Amygdaloideae)梨属(Pyrus L.)的多年生木本植物，是我国第三大果树树种，有大约3000年的栽培历史。除海南省外，其他各个地区均有梨的栽培，尤其是在我国的河北、安徽及江苏等省份，栽培面积广。但是，我国梨果在国外市场的竞争力较弱，出口量和出口价格都远低于日本还有西方其他国家，究其原因主要是由于我国梨果的综合品质较低，其中果实石细胞含量较高造成的口感粗糙，是影响梨口感品质的重要原因之一。因此，研究石细胞合成与调控的机制，对于降低果肉石细胞含量，提高果实品质尤为重要。
[0003]石细胞属于厚壁细胞，具有增厚的次生细胞壁，由薄壁细胞在细胞壁二次沉积木质素等成分发育而来，因此，梨果肉石细胞的形成与木质素的生物合成、转运、积累具有很高相关性。木质素通常可以被间苯三酚盐酸溶液染成紫红色，这一反应是基于木质素中含有的松柏醇结构而发生的，通过这一检测方法，石细胞中的木质素形成可以被可视化。
[0004]已有关于木质素合成相关基因的研究多集中在模式植物中，而以梨果实为材料研究木质素合成基因功能的研究相对较少，其主要原因是梨为多年生果树，童期较长、遗传转化系统不完善，基因功能验证耗时久、且低效。因此，如果利用梨愈伤组织为试验材料，实现木质素合成的可视化检测，对于基因功能验证和调控机制研究是十分高效的解决策略。但是，目前尚未有梨果肉愈伤组织木质素合成诱导体系的报道。
[0005]研究发现，在没有外源处理的情况下，梨果肉愈伤组织处于脱分化的状态，无法合成木质素，即使过量表达木质素合成基因，也检测不到果肉愈伤木质素的合成，难以用来开展石细胞和木质素合成及调控机制的研究。本专利技术创新了一种对梨果肉愈伤组织进行激素处理诱导木质素合成的方法。该系统不仅有效提高了梨果实木质素合成相关基因在同源系统中功能验证的效率，也为植物生长调节剂调控梨果实石细胞合成提供了理论依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种梨果实愈伤组织木质素合成的高效诱导体系。
[0007]本专利技术的另一目的是提供该体系的应用。
[0008]本专利技术的又一目的是提供一种诱导梨果肉愈伤组织木质素合成的方法。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种梨果实愈伤组织木质素合成的高效诱导体系及应用，包括以下步骤：
[0010]一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系，由继代培养基和处理培养基组成；所述的继代培养基通过以下方法配制：1L水中加入4.74g MS固体培养基和30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入8g琼脂粉和4.5uM 2,4
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D；所述的处理培养基通过以下
方法配制： 1L水中加入4.74g MS固体培养基和30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入8g琼脂粉和EBR(表油菜素内酯)，其中EBR浓度为0～10uM。
[0011]作为本专利技术的一种优选，所述的处理培养基中EBR浓度为1～10uM。
[0012]作为本专利技术的进一步优选，所述的处理培养基中EBR浓度为10uM。
[0013]本专利技术所述的高效诱导体系在梨愈伤组织木质素合成中的应用。
[0014]本专利技术所述的高效诱导体系在木质素生物合成基因功能验证中的应用。
[0015]一种诱导梨果肉愈伤组织木质素合成的方法，其特征在于包含以下步骤：
[0016](1)将梨果肉愈伤组织置于权利要求1中所述的继代培养基中培养；
[0017](2)将继代培养基中正常生长的梨果肉愈伤组织转移到权利要求1中所述的处理培养基中培养。
[0018]作为本专利技术的一种优选，步骤(1)中在继代培养基中的培养条件为黑暗培养箱中，温度为 25
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28℃的条件下培养，每15天继代一次。
[0019]作为本专利技术的一种优选，步骤(2)中在处理培养基中的培养条件为黑暗培养箱中，温度为 25
‑
28℃的条件下培养。
[0020]作为本专利技术的一种优选，所述的方法，还包括步骤(3)对继代培养基和处理培养基中生长的梨果肉愈伤组织进行木质素检测。
[0021]作为本专利技术的一种优选，所述木质素检测的方法为间苯三酚
‑
盐酸染色或溴乙酰法。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果：
[0023]1.本专利技术发现在梨果肉愈伤组织木质素合成的诱导过程中，不同植物激素起的作用不同，生长素抑制木质素合成，表油菜素内酯促进木质素合成，为外源使用植物生长调节剂降低石细胞合成提供了理论依据。
[0024]2.通过农杆菌介导遗传转化方法将木质素合成调控基因PbrMYB169转化梨愈伤，获得转基因愈伤组织，经过诱导体系处理，木质素合成显著增强，具有应用于木质素合成相关基因功能验证的价值。该系统不仅有效提高木质素合成相关基因在同源系统中功能验证的效率，也为利用外源植物生长调节剂降低梨果实石细胞合成提供了理论依据，是一种实用、高效、便捷的诱导梨果肉愈伤组织合成木质素的体系。
附图说明
[0025]图1为本专利技术实施例1的梨果肉愈伤组织间苯三酚
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盐酸染色图片。
[0026]其中：2,4
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D：生长素类似物；EBR：表油菜素内酯。
[0027]图2为本专利技术实施例1的梨果肉愈伤组织木质素含量分析。
[0028]图3为本专利技术实施例2的梨果肉愈伤组织间苯三酚
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盐酸染色图片。
[0029]图4为本专利技术实施例2的梨果肉愈伤组织木质素含量分析。
[0030]图5为PbrMYB169基因超表达影响梨果肉愈伤组织木质素合成。
[0031]其中：图A，过表达PbrMYB169基因在转基因梨果肉愈伤组织的表达量分析。EV为转化空载的梨果肉愈伤组织，其余编号：转基因系。图B，转基因梨果肉愈伤组织木质素含量，*表示差异显著。图C，转基因梨果肉愈伤组织间苯三酚
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盐酸染色图片。图D，PbrMYB169基因超表达影响木质素合成酶相关基因的表达。
具体实施方式
[0032]以下结合具体实施例对本专利技术做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
[0033]实施例1梨果肉愈伤继代与激素处理
[0034](1)梨果肉组织愈伤继代
[0035]将茄梨果肉诱导的愈伤组织置于继代培养基上培养。继代培养基按以下方法配制：1L水中加入4.74g MS固体培养基，30g蔗糖和4.5uM 2,4
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D并加热本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种梨果肉愈伤组织木质素合成的高效诱导体系，其特征在于由继代培养基和处理培养基组成；所述的继代培养基通过以下方法配制：1L水中加入4.74g MS固体培养基和30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入8g琼脂粉和4.5uM 2,4
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D；所述的处理培养基通过以下方法配制：1L水中加入4.74g MS固体培养基和30g蔗糖并加热溶解，调pH至5.8～6.0，然后加入8g琼脂粉和EBR，其中EBR浓度为0～10uM。2.根据权利要求1所述的高效诱导体系，其特征在于所述的处理培养基中EBR浓度为1～10uM。3.根据权利要求1所述的高效诱导体系，其特征在于所述的处理培养基中EBR浓度为10uM。4.权利要求1
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3中任一项所述的高效诱导体系在梨愈伤组织木质素合成中的应用。5.权利要求1
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3中任一项所述的高效诱导体系在木质素生物合成基因功能验...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊，薛雍松，单燕飞，薛程，刘东亮，李甲明，赵渴娇，汪润泽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：