一种外泌体上KL-6蛋白含量的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种外泌体上KL

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质检测
，涉及一种外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法及其应用，具体涉及一种外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法以及一种诊断肺部疾病的试剂盒。

技术介绍

[0002]KL
‑
6(涎液化糖链抗原，Krebs Von den Lungen
‑
6)，是Kohno于1985年发现的，利用人肺腺癌细胞系(VMRC
‑
LCR)免疫小鼠制备了多株单克隆抗体，将其中的第6号抗体识别的涎液化糖链抗原命名为KL
‑
6。KL
‑
6主要由增殖、再生的或受损的肺泡II型上皮细胞分泌，在正常肺组织中，KL
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6在II型肺泡上皮细胞、呼吸细支气管上皮细胞和支气管腺浆液细胞上表达。当肺部发生炎症尤其是与II型肺泡相关的肺炎时，II型肺泡的大量死亡和再生以及肺间质上皮细胞屏障的破损会导致KL
‑
6大量释放到血液中。多项针对KL
‑
6的研究显示，其作为间质性肺疾病(Interstitial Lung Diseases,ILDs)的血清学指标显示出积极的临床意义。因此测量外周血KL
‑
6的水平可用于间质性肺炎的诊断和治疗策略的确定。其中，血清被认为是理想的测试样品，因为它可以无创地重复收集，然而，其中包含的99％以上的蛋白质是无关蛋白(如白蛋白等)，从检测角度考虑，这些蛋白质是杂质，会影响检测的准确度。
[0003]外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30
‑
150nm)，现今，其特指直径在40
‑
100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，能够参与细胞间通讯，近年来，人们对外泌体的研究兴趣日益增长。研究表明，外泌体中含有多种与各种细胞生理活动相关的蛋白质，然而外泌体上的KL
‑
6蛋白的含量情况及其功能尚不清楚，目前有关外泌体上KL
‑
6蛋白的检测方法也未见报道。
[0004]因此，开发一种外泌体上KL
‑
6含量的方法将对于外泌体相关研究以及KL
‑
6蛋白的功能研究等领域具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法及其应用，具体提供一种外泌体中KL
‑
6蛋白含量的检测方法以及一种诊断肺部疾病的试剂盒。
[0006]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
[0008](1)将捕获抗体标记的磁珠与待测外泌体样本混合，反应，得磁珠
‑
外泌体复合物；
[0009](2)将步骤(1)得到的磁珠
‑
外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合，反应，得
磁珠
‑
外泌体
‑
检测抗体复合物；
[0010](3)将步骤(2)得到的磁珠
‑
外泌体
‑
检测抗体复合物与发光底物混合，反应，利用化学发光法检测反应体系的发光强度；
[0011](4)利用标准曲线法，根据步骤(3)检测得到的发光强度计算得到待测外泌体样本的KL
‑
6蛋白含量。
[0012]本专利技术首次提出外泌体上KL
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6蛋白含量的检测方法，检测的原理如附图1所示，图中1—捕获抗体标记的磁珠；2—含有KL
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6蛋白的外泌体；3—发光物标记的检测抗体。通过捕获抗体与KL
‑
6蛋白的特异性结合作用以及检测抗体与KL
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6蛋白的特异性结合作用，构建得到磁珠
‑
外泌体
‑
检测抗体复合物，由于检测抗体上标记有发光物，因此通过检测反应体系的发光强度可以间接反映外泌体上KL
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6蛋白含量信息。通过标准曲线法，即可计算出KL
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6蛋白含量的具体数值。本专利技术提供的检测方法具有较好的稳定性，基于本专利技术提供的检测方法得到的检测结果与传统的血清检测得到的结果显著相关，证明了本专利技术检测方法具有较高的准确性和可行性，在外泌体相关基础研究等领域具有重要的应用价值。基于此检测方法，本专利技术首次发现外泌体上KL
‑
6蛋白含量与肺部患病情况有较大的相关性，此发现对于肺部疾病的机理研究以及临床诊断等方面具有重要意义。
[0013]优选地，步骤(1)所述反应的温度为33
‑
40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5
‑
15min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
[0014]优选地，步骤(2)所述反应的温度为33
‑
40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5
‑
15min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
[0015]优选地，步骤(3)所述反应的温度为33
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40℃，例如33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。所述反应的时间为5
‑
10min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
[0016]优选地，所述待测外泌体样本由全血、血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、脑脊液或尿液中的任意一种待测样本制备得到。
[0017]优选地，所述待测外泌体样本的制备方法包括离心法、超滤法、磁珠免疫法、聚乙二醇沉淀法或试剂盒提取法中的任意一种，优选离心法。
[0018]优选地，所述离心的转速为10000
‑
20000g，例如10000g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g等。所述离心的时间为1
‑
2h，例如1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h等。
[0019]作为本专利技术的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体上KL
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6蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述外泌体上KL
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6蛋白含量的检测方法包括如下步骤：(1)将捕获抗体标记的磁珠与待测外泌体样本混合，反应，得磁珠
‑
外泌体复合物；(2)将步骤(1)得到的磁珠
‑
外泌体复合物与发光物标记的检测抗体混合，反应，得磁珠
‑
外泌体
‑
检测抗体复合物；(3)将步骤(2)得到的磁珠
‑
外泌体
‑
检测抗体复合物与发光底物混合，反应，利用化学发光法检测反应体系的发光强度；(4)利用标准曲线法，根据步骤(3)检测得到的发光强度计算得到待测外泌体样本的KL
‑
6蛋白含量。2.如权利要求1所述的外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述反应的温度为33
‑
40℃，所述反应的时间为5
‑
15min；优选地，步骤(2)所述反应的温度为33
‑
40℃，所述反应的时间为5
‑
15min；优选地，步骤(3)所述反应的温度为33
‑
40℃，所述反应的时间为5
‑
10min。3.如权利要求1或2所述的外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述待测外泌体样本由全血、血浆、血清、支气管肺泡灌洗液、脑脊液或尿液中的任意一种待测样本制备得到。4.如权利要求1
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3中任一项所述的外泌体上KL
‑
6蛋白含量的检测方法，其特征在于，所述待测外泌体样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏金，董鸣，李军旗，魏新茹，肖云鹏，
申请(专利权)人：广州呼吸健康研究院，
类型：发明
国别省市：