一种窄谱抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程和生物制药技术领域，公开了一种窄谱抗菌肽及其应用，窄谱抗菌肽(G2)的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。所述的窄谱抗菌肽在制备抗微生物感染药物中的应用，所述微生物主要为肠道及食源性致病菌。结果显示本发明专利技术G2抗菌肽抗菌谱窄，对艰难梭菌(Clostridium difficile)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)及大肠杆菌(Escherichia coli)O157具有较强的抗菌活性，并且具有良好的温度、pH和血清稳定性；生物安全性实验显示G2抗菌肽无明显的溶血活性及细胞毒性。胞毒性。

【技术实现步骤摘要】
一种窄谱抗菌肽及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程和生物制药
，特别涉及抗菌肽及其设计和应用，该抗菌肽抗菌谱窄，对几种致病菌如艰难梭菌、大肠杆菌O157和鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果显著。

技术介绍

[0002]近年来，随着多重耐药致病菌的出现，大多数致病菌对抗生素产生了严重的耐药性，导致抗生素的治疗效果大大降低，严重威胁人类的生命健康。抗菌肽(Antimicrobial peptide,AMP)，是由自然界生物体分泌的一类具有重要免疫保护功能的多肽，分子量小，一般由10
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100个氨基酸组成。由于其抗菌机制独特，不易产生耐药性等特点，近年来受到科学家们的密切关注。迄今为止，科学家们已成功从自然界(包括细菌、古生菌、真菌、原生动物、植物以及动物)中发现约3180种天然抗菌肽，其中绝大多数抗菌肽从动物内体提取获得，这些肽对G+和G
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细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等展现出良好的广谱抗菌活性。然而，天然抗菌肽也存在一定的缺陷，如抗菌活性差异大，稳定性不高以及对哺乳动物细胞具有毒性等，严重阻碍了抗菌肽的进一步研究。近年来，科学家们采用多种手段如氨基酸突变、从头设计等策略来定向设计抗菌活性高、稳定性好、生物安全性高的新型抗菌肽。如Zhu等通过选择一系列避免被胰蛋白酶和胃蛋白酶识别的氨基酸序列进行抗菌肽设计，最终筛选得到的II
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I4
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II抗菌肽不仅热稳定性好，并且在蛋白酶、盐离子、血清及酸碱溶液中都表现出很好的稳定性(Rational Avoidance of Protease Cleavage Sites and Symmetrical End
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Tagging Significantly Enhances the Stability and Therapeutic Potential of Antimicrobial Peptides.J Med Chem 2020,63(17):9421
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9435.)；Feng等通过氨基酸突变的方法研究色氨酸突变对从鸭肉中提取的抗菌肽dCATH的细胞毒性及抗菌活性的影响，最终成功筛选获得具有高抗菌活性和生物安全性的dCATH衍生肽dCATH(1
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16)和dCATH(5
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20)(The Critical Role of Tryptophan in the Antimicrobial Activity and Cell Toxicity of the Duck Antimicrobial Peptide DCATH.Front Microbiol.2020 May 28；11:1146.)。然而目前研究及设计的抗菌肽绝大多数为广谱型抗菌肽，可同时对多种院内感染常见的病原菌，如绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、多重耐药鲍曼不动杆菌或肺炎双球菌等表现出的良好抗菌活性，但同时也对大多数益生菌有明显的抑制作用，对单一或少数几种致病菌具有高特异抗菌活性的窄谱抗菌肽鲜有报道。近年来，随着大多数致病菌对传统抗生素产生严重耐药性的增加，由致病菌感染导致死亡的人口呈逐年上升的趋势，特别是目前感染较为严重的致病菌如艰难梭菌(Clostridium difficile，C.difficile)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.Aeruginosa)、沙门氏菌(salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157等。因此，设计特异性高、可正确识别正常菌群与致病菌的窄谱抗菌肽，对于控制特殊病原菌感染具有重要意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的不足，设计并筛选获得一种窄谱抗菌肽，包括如下步骤：以大肠杆菌膜通道蛋白CsgG作为设计模板，通过分析CsgG螺旋跨膜区域的氨基酸组成及三级结构特征，结合PEW300抗菌肽的氨基酸序列，设计出抗菌肽G2。通过融合策略将G2抗菌肽与自聚集肽ELK16进行融合表达，实现G2在大肠杆菌中的高效表达与纯化，并对制备的G2抗菌肽进行抗菌活性、稳定性及生物安全性测试。抑菌实验结果显示该抗菌肽对艰难梭菌、大肠杆菌O157、鼠伤寒沙门氏菌抑菌活性显著；对其他细菌如双歧杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、绿脓杆菌、蜡样芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸杆菌无显著抑菌活性。
[0004]本专利技术的另一目的在于基于上述设计的抗菌肽G2，对其进行高效表达并进行抗菌性能表征，提供抗菌肽G2的应用。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0006]一种窄谱抗菌肽(G2)，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
[0007]编码所述窄谱抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
[0008]所述的窄谱抗菌肽在制备抗微生物感染药物中的应用。
[0009]优选地，所述微生物为肠道及食源性致病菌。
[0010]优选地，所述微生物为艰难梭菌(Clostridium difficile)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)及大肠杆菌(Escherichia coli)O157。
[0011]一种窄谱抗菌肽G2的制备方法，包括如下步骤：
[0012](1)分析大肠杆菌膜通道蛋白CsgG及PEW300抗菌肽(该抗菌肽为天蚕素A抗菌肽的突变体肽)的氨基酸序列及理化性质特征。根据电荷特性及疏水特性分析，设计获得抗菌肽G2，根据G2氨基酸序列确定其基因序列；
[0013](2)将步骤(1)中的抗菌肽基因连接到表达载体上，得到重组表达载体；
[0014](3)将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌表达宿主菌中，得到工程菌；
[0015](4)步骤(3)中得到的工程菌中加入表达诱导剂(IPTG)进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体，离心获得沉淀(即融合蛋白活性聚集体)，再向沉淀中加入切割诱导剂(DTT)进行诱导切割，离心收集沉淀，对沉淀添加冰乙酸处理，离心收集上清，得到G2抗菌肽。
[0016]优选地，步骤(2)所述重组表达载体包含G2抗菌肽融合蛋白，该融合蛋白的组成为：G2抗菌肽
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自剪切短肽
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连接肽
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自聚集短肽。
[0017]优选地，所述的自剪切短肽为Mxe GyrA，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
[0018]优选地，所述的自聚集短肽为ELK16，其核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。
[0019]优选地，所述的连接肽为PT linker，其核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
[0020]优选地，步骤(4)所述IPTG的浓度为0.1mM；DTT的浓度为40mM；所述诱导表达的温度为16℃，诱导表达的时间为24h；所述诱导切割的温度为在4℃，切割时间为12h。
[0021]优选地，步骤(4)中所述的冰乙酸浓度为3％(v/v)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种窄谱抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。2.编码权利要求1所述窄谱抗菌肽的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。3.权利要求1所述的窄谱抗菌肽在制备抗微生物感染药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，王蒙，马毅，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：