一种血源人凝血因子制造技术

本发明专利技术涉及血液制品技术领域，具体涉及一种血源人凝血因子

【技术实现步骤摘要】
一种血源人凝血因子
Ⅷ
/血管性血友病因子复合物生产工艺


[0001]本专利技术涉及血液制品
，具体涉及一种血源人凝血因子
Ⅷ
/血管性血友病因子复合物生产工艺。

技术介绍

[0002]血浆来源的人凝血因子
Ⅷ
/血管性血友病因子复合物为健康人的血浆经分离、提纯技术制成的血浆蛋白组分，同时含有人凝血因子
Ⅷ
(Coagulation Factor
Ⅷ
，F
Ⅷ
)和人血管性血友病因子(von Willebrand Factor，VWF)。
[0003]美国食品药品监督管理局批准的F
Ⅷ
/VWF复合物分别为Alphanate、Wilate、Humate
‑
P，均可用于F
Ⅷ
不足或缺陷导致的遗传性A型血友病(Hemophilia A，HA)和VWF不足或缺陷导致的血管性血友病(von Willebrand Disease，VWD)的治疗。上述产品中，Alphanate的生产工艺自血浆经过离心制备冷沉淀，冷沉淀溶解后，采用PEG沉淀，经过离心的上清液经过肝素亲和层析，再经过离子交换层析，以及盐析沉淀工艺，制备的F
Ⅷ
/VWF复合物中VWF:F
Ⅷ
为1:2.5。该产品仅层析步骤就采用了两步层析工艺，工艺较为复杂，且选取的肝素亲和层析凝胶价格极其昂贵，产品的性价比不佳，同时产品工艺还引入了外源性的PEG物质，存在安全性风险。/>[0004]Wilate的生产工艺自血浆经过离心制备冷沉淀，冷沉淀溶解后，主要采用离子交换层析与凝胶过滤层析，制备的F
Ⅷ
/VWF复合物中VWF:F
Ⅷ
为1.1:1。该产品仅层析步骤也采用了两步层析工艺，工艺较为复杂，且选取的凝胶过滤层析限制了生产规模的放大。
[0005]Humate
‑
P的生产工艺自血浆经过离心制备冷沉淀，冷沉淀溶解后，经低温沉淀、氢氧化铝吸附、甘氨酸沉淀、盐析沉淀、巴氏灭活制备的F
Ⅷ
/VWF复合物中VWF:F
Ⅷ
为2:1。该产品整个制备过程不使用层析技术，但经三步沉淀法，工艺极为复杂；同时产品工艺还引入了氢氧化铝，存在安全性风险。
[0006]根据国外已报道的文献描述，意大利的Kedrion公司通过对血浆制备的冷沉淀经过肝素溶液溶解，进行氢氧化铝吸附，吸附后的上清液经过S/D病毒灭活后进行一步阴离子交换层析，即可制备出F
Ⅷ
/VWF复合物产品。虽然该工艺较为简洁，但该工艺制备的产品VWF多聚体分析结果显示含量较低，很大部分的VWF多聚体在层析过程中损失到了层析的洗涤液中。产品工艺也引入了外源性的氢氧化铝物质，存在安全性风险。
[0007]国内已有多家研究机构进行关于F
Ⅷ
/VWF复合物的研究，如国内专利(申请号CN202010556926.4)报道的一种血源人凝血因子VIII/血管性血友病因子复合物生产工艺，其工艺步骤自原料血浆至成品包含三步离心，一步氢氧化铝凝胶吸附，两步超滤，一步阴离子层析，制备的成品中VWF:F
Ⅷ
的比例为1:1。该产品的工艺也引入了外源性的氢氧化铝。
[0008]随着对F
Ⅷ
/VWF复合物研究的不断深入，其用药的安全性，有效性正逐渐引起重视。根据国外已上市产品说明书，如Wilate产品中提到，在治疗VWD患者时，应密切监控患者体内的F
Ⅷ
水平。为防止可能产生的凝血混乱，应严格控制患者用药过程中引起的F
Ⅷ
水平上升，不应超过250％。相对应的，在治疗HA患者时，并无关于VWF水平的监控要求，说明VWF
的用药安全性高于F
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。因此，基于临床使用考虑，产品中的VWF:F
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的效价比例应至少≥1.5，才可确保危重患者在大剂量用药时的安全性。同时，应注意避免残留在产品中的其他凝血因子类杂质的激活，如F
Ⅺ
a、F
Ⅹ
a、F
Ⅶ
a及凝血酶等，均可引起患者用药后的凝血系统紊乱。根据Ulrich Budde,M.D.等研究，在VWD 2型患者中，其VWF:RCo(或CB)与VWF:Ag的比例过低。VWF的生物学研究发现，由内皮细胞和巨噬细胞分泌并生成多聚体后，其多聚体的状态随着在体内的转运或体外的机械损伤等的影响，会一直处于多聚体的降解状态，其直接表现形式即为VWF:RCo(或CB)与VWF:Ag比例的降低。结合上述VWD 2型患者的病理研究，为了确保F
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/VWF复合物临床应用的有效性，尤其针对VWD的1、2、3型病人的治疗，应保证产品中多聚体的高聚物比例维持在较高的水平。
[0009]基于上述研究的方向，F
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/VWF复合物的工艺设计首先应简洁，尽量避免产品制备过程中的物理及化学损伤，并尽早加入保护剂，以维持VWF多聚体的高聚物比例以及F
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的稳定性，并考虑避免凝血因子杂质的激活。基于临床使用考虑，产品中的VWF:F
Ⅷ
的效价比例应至少≥1.5。

技术实现思路

[0010]针对现有F
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/VWF复合物生产存在的工艺较为复杂、引入外源性物质的技术问题，本专利技术提供一种血源人凝血因子
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/血管性血友病因子复合物生产工艺，自血浆至成品，仅需两步离心、一步层析、一步超滤，工艺步骤简单，不引入如氢氧化铝、PEG等非人体自身含有的外源物质。
[0011]一种血源人凝血因子
Ⅷ
/血管性血友病因子复合物生产工艺，包括如下步骤：
[0012](1)血浆制备冷沉淀，冷沉淀溶解，粗制杂质去除：冷沉淀溶解后及粗制杂质去除后分别对制品搅拌孵育；
[0013](2)制品氨基酸保护孵育：使用保护成分保护孵育，所述保护成分包括精氨酸或其盐、赖氨酸或其盐中的至少一种，其中所述精氨酸的盐包括但不限于其盐酸盐、硫酸盐等形式，赖氨酸的氨基酸盐包括但不限于其盐酸盐、硫酸盐等形式；
[0014](3)S/D病毒灭活；
[0015](4)离子交换层析：上样前使用含保护成分的溶液对层析填料进行孵育；
[0016](5)超滤配制；
[0017](6)分装，冻干，干热。
[0018]进一步的，步骤(1)具体为：
[0019]血浆制备冷沉淀，冷沉淀溶解，调节溶解后制品pH值至7.0
±
0.5、温度至25
±
1℃，搅拌孵育1～6小时，孵育结束后，调节制品pH至6.0
±
0.5、温度15
±
1℃，酸沉淀0.5～3小时，酸沉淀结束后，再搅拌孵育0.5～3小时；离心收集酸沉淀上清液。
[0020]在冷沉淀溶解以及酸沉淀工序后增加孵育步骤，使杂蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血源人凝血因子
Ⅷ
/血管性血友病因子复合物生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：(1)血浆制备冷沉淀，冷沉淀溶解，粗制杂质去除：冷沉淀溶解后及粗制杂质去除后分别对制品搅拌孵育；(2)制品氨基酸保护孵育：使用保护成分保护孵育，所述保护成分包括精氨酸或其盐、赖氨酸或其盐中的至少一种；(3)S/D病毒灭活；(4)离子交换层析：上样前使用含保护成分的溶液对层析填料进行孵育；(5)超滤配制；(6)分装，冻干，干热。2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(1)具体为：血浆制备冷沉淀，冷沉淀溶解，调节溶解后制品pH值至7.0
±
0.5、温度至25
±
1℃，搅拌孵育1～6小时，孵育结束后，调节制品pH至6.0
±
0.5、温度15
±
1℃，酸沉淀0.5～3小时，酸沉淀结束后，再搅拌孵育0.5～3小时；离心收集酸沉淀上清液。3.如权利要求2所述的生产工艺，其特征在于，步骤(1)中，使用血浆离心制备冷沉淀，离心力为1000～5500g，制备的冷沉淀在35
±
1℃下用含1～2U/ml肝素的注射用水搅拌溶解，冷沉淀和注射用水的质量比为1:2～1:3。4.如权利要求2所述的生产工艺，其特征在于，步骤(2)具体为：在步骤(1)离心收集酸沉淀上清液的同时加入保护成分，使制品含保护成分20～30g/kg，调节制品pH值至7.0
±
0.5，酸沉淀上清液收集完成后，于1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文杰，杨西建，郭全娟，徐一轲，史文强，高建锋，马杰，刘坤，陈振，周安，菅长永，
申请(专利权)人：山东泰邦生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：