一种通用型CAR-T细胞的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了种通用型CAR

【技术实现步骤摘要】
一种通用型CAR
‑
T细胞的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，更具体地，涉及一种通用型CAR
‑
T细胞的制备方法。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体T细胞(CART)治疗癌症患者已显示出令人振奋的结果。但是，目前大多数CAR
‑
T临床试验使用的是自体T细胞，因此可能会受到T细胞质量和数量不佳(如接受放化疗的患者)以及制造自体CAR
‑
T细胞产品的时间和费用的限制。
[0003]异体来源的T细胞目前主要有：外周血来源T细胞，脐带血来源的T细胞，ips细胞诱导分化的T细胞。使用来自异体ips细胞诱导分化的T细胞可以克服这些缺陷。(传代次数多(100代)，大量生产，降低成本，冷冻保存以备随时使用)。但是异体IPSC来源的T细胞存在的最大问题是会引起免疫排斥反应。因此如何消除异体IPSC来源的T细胞引起的免疫排斥是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术所描述的上述缺陷，首先提供一种通用型CAR
‑
T细胞的制备方法。
[0005]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0006]一种通用型CAR
‑
T的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1、制备IPSC：将携带三种转录因子(KOS，hc
‑
Myc，hKlf4)的仙台病毒感染T细胞，获得T细胞来源的IPSC；
[0008]S2、利用三质粒系统或者四质粒系统包装单链可变片段基因序列及CD47基因序列的慢病毒；
[0009]S3、利用S2得到的慢病毒感染S1得到的IPSC，所述IPSC的细胞表面表达含有针对CD19的单链可变片段及CD47分子；
[0010]S4、构建B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体并电转入CD47
+
CAR
‑
iPSC，获得HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
iPSC；
[0011]S5、将HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
iPSC诱导成T细胞，获得HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
T细胞。
[0012]本专利技术通过CAR
‑
T的DNA序列及CD47分子的DNA序列插入到iPS细胞的AAVS1位点，并将B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体转入iPS细胞，最后将得到的CAR
‑
iPS细胞分化成T细胞获得通用型CAR
‑
T细胞。本专利技术制备的通用型CAR
‑
T细胞由CD47+/HLAI
‑
，CAR
‑
iPS分化获得，CAR
‑
T细胞高表达CD47,不表达HLAI。相对于慢病毒感染获得的CAR
‑
T细胞，CAR
‑
iPSC分化获得的CAR
‑
T细胞纯度更高，可以接近于100％。且由于iPS可近乎无限增殖，因此由CAR
‑
iPSC获得的CAR
‑
T细胞也可近乎无限获得，不受外周血分离影响。且CD47+/HLAI
‑
，CAR
‑
T细胞不但可逃避异体T细胞的杀伤，且不会发生“丢失自我”反应，能够避免异体NK细胞的吞噬，是一种真正意义上的通用型CAR
‑
T细胞。
[0013]优选的，所述的IPSC细胞的来源包括但不限于T细胞、PBMC、成纤维细胞、造血干细胞。
[0014]优选的，所述单链可变片段选自CD19、EGFRVIII、间皮素、CD133、CEA的scFv。
[0015]优选的，所述电转的参数为：电压1000V、时间30ms，电击次数为1
‑
2次。
[0016]之前的一些研究表明来自CAR
‑
IPSC分化成的CAR
‑
T细胞、CAR
‑
NK细胞或CAR
‑
巨噬细胞，对特定的肿瘤抗原具有良好的靶向性和杀伤能力。因此，优选地，所述HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
IPSC分化的免疫细胞包括但不限于CAR
‑
T细胞、CAR
‑
NK细胞或CAR
‑
巨噬细胞。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0018](1)本专利技术通过在CAR
‑
IPSC上过表达CD47并将其诱导分化成CAR
‑
T细胞，克服了使用异体CAR
‑
T治疗肿瘤时可能出现的免疫排斥反应及“丢失自我”反应引起的NK细胞吞噬。
[0019](2)相对于慢病毒感染获得的CD47
+
CAR
‑
T细胞，本专利技术通过CAR
‑
IPSC分化获得的CAR
‑
T纯度更高，可以接近于100％。
[0020](3)相对于Crispr/Cas9基因敲除系统敲除CAR
‑
T细胞获得的HLAI
‑
CAR
‑
T细胞，本专利技术通过HLAI
‑
CAR
‑
IPSC分化获得的HLAI
‑
CAR
‑
T纯度更高，可以接近于100％。
[0021](4)本专利技术制备的HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
T细胞由HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
iPS分化获得，iPS细胞可增殖周期长，更便于进行基因修饰。
[0022](5)HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
IPSC诱导的的HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
T细胞可近乎无限获得，不受外周血分离影响。
[0023](6)使用HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
IPSC诱导得到HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
T细胞，来源于同一株单克隆，DNA遗传信息均一稳定。
[0024](7)相对于现有的Crispr/Cas9基因敲除系统敲除CAR
‑
T细胞获得的通用型HLAI
‑
CAR
‑
T细胞，HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型CAR
‑
T的制备方法，包括以下步骤：S1、制备IPSC：将携带三种转录因子KOS，hc
‑
Myc和hKlf4的仙台病毒感染T细胞，获得T细胞来源的IPSC；S2、利用三质粒系统或者四质粒系统包装单链可变片段基因序列及CD47基因序列的慢病毒；S3、利用S2得到的慢病毒感染S1得到的IPSC，所述IPSC的细胞表面表达含有针对CD19的单链可变片段及CD47分子；S4、构建B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体并电转入CD47
+
CAR
‑
iPSC，获得HLAI
‑
CD47
+
CAR
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，王荣浩，汤蓝天，
申请(专利权)人：钦元再生医学珠海有限公司，
类型：发明
国别省市：