用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，其中至少一种目的基因的表达受到特异性抑制其表达的分子的抑制。本发明专利技术还涉及用于生产修饰的噬菌体的组合物和试剂盒。此外，本发明专利技术涉及一种没有在基因组水平而是在蛋白质组水平上修饰的噬菌体及其在治疗、诊断和检测测定中的用途。诊断和检测测定中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产不含基因组修饰的修饰的噬菌体的方法


[0001]本专利技术涉及一种用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，其中至少一种目的基因的表达受到特异性抑制其表达的分子的抑制。本专利技术还涉及用于生产修饰的噬菌体的组合物和试剂盒。此外，本专利技术涉及一种没有在基因组水平而是在蛋白质组水平上修饰的噬菌体及其在治疗、诊断和检测测定中的用途。

技术介绍

[0002]噬菌体是专门感染宿主细菌并利用细菌繁殖的病毒。噬菌体的生物技术应用非常广泛，从基于进化的选择方法，例如酶活性的进化改进(Esvelt等人2011)，到所谓的噬菌体展示，其可用于产生和优化生物药物，例如治疗性抗体(Bazan等人2012)，到噬菌体本身在噬菌体治疗中作为抗生素的替代品使用(Barbu等人2016)。后者基于噬菌体特异性攻击和破坏病原菌(裂解)的天然能力。然而，基于噬菌体的治疗剂和诊断剂的开发和生产仍然受到用于噬菌体的简单且安全的生产方法中困难的阻碍。到目前为止，噬菌体是通过与合适的细菌/病原体一起培养产生的(Pirnay等人,2018)。这需要遵守相应细菌的适当安全规定，以及培养它们的可能性。对于危险病原体，由于需要在特殊设施中经过专门培训的人员，因此处理非常困难且成本高昂。
[0003]相对于细胞表达，蛋白质的无细胞合成具有许多优势，尤其是在生产对于细菌有毒的蛋白质或将非天然氨基酸引入蛋白质时。蛋白质合成可以用裂解的细胞的转录和翻译装置进行。纯化后，细胞裂解物不含宿主DNA，并且能够通过外部添加DNA来表达期望的蛋白质。甚至可以同时合成多种蛋白质或代谢物(Garamella等人2016)。许多无细胞表达系统可用，其组成可能有很大差异。所谓的“PURE系统”(Shimizu等人2001)由纯化的蛋白质组成，而大肠杆菌的粗细胞提取物包含几乎所有的细胞内蛋白质，包括对于表达不需要的那些(Sun等人2013)。在这种粗细胞提取物中，已经表明可以表达感染性野生型噬菌体(Shin等人2012)以及蛋白质(Garamella等人2016)。
[0004]然而，基于噬菌体的治疗剂和诊断剂的开发和生产目前仍受到噬菌体修饰困难的阻碍。例如，遗传修饰可以增加噬菌体的宿主范围(Brown等人2017)，提高细菌生物膜的分辨率(Lu and Collins 2007)，或引入用于诊断目的的标记蛋白(Hagens and Loessner 2014)。用于噬菌体修饰的经典方法是“基因组编辑”，其通常通过在宿主细菌中同源重组进行。为此，需要插入具有两个同源DNA序列的DNA片段，待插入的DNA序列位于它们之间。由于有时非常短的感染时间和其它限制，只有很小一部分噬菌体发生改变——重组率仅在10
‑
10
和10
‑4之间——这使得对噬菌体进行广泛筛选是必要的(Pires等人2016)。这种方法可以通过分子生物学方法进一步优化，例如攻击未修饰的噬菌体的I
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E型CRISPR
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Cas系统。然而，由于缺乏实验方法，将质粒或DNA片段引入宿主细菌中并不总是可能的(Kiro等人2014)。噬菌体修饰的复杂性主要是由于改变噬菌体基因组的难度。修饰噬菌体的另一种可能性是在噬菌体的基因缺失后添加相应的蛋白质。这仅适用于有限数量的衣壳蛋白，因为噬菌体仍然需要在细菌中组装。

技术实现思路

[0005]因此，需要一种快速且不太费力的通用方法来修饰噬菌体，而不修饰噬菌体的基因组。
[0006]为了解决这个问题，本专利技术人建立了一种体外表达系统，其中来自噬菌体的天然基因组的表达受到抑制。
[0007]因此，本专利技术的第一方面涉及用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：
[0008]‑
将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，
[0009]‑
通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。
[0010]因此，对于所描述的方法，不需要修饰噬菌体的基因组。换句话说，本专利技术涉及用于产生在蛋白质组水平而非基因组水平包含修饰的噬菌体的方法、组合物和试剂盒。
[0011]由此产生的噬菌体并不代表遗传修饰生物体(GMO)，这是非常有利的，因为其可以避免这样的噬菌体用于治疗目的的批准过程中的障碍。此外，通过提供的方法获得的噬菌体可以安全地释放到环境中，因为它们的修饰不会传递给下一代噬菌体。此外，无细胞系统中的基因表达避免了对噬菌体基因组进行繁琐的遗传修饰。
[0012]如本文所用，产生“修饰的噬菌体”是指其中至少一种目的基因被抑制(也称为敲低)的噬菌体。因此，噬菌体的修饰包括至少蛋白质的敲低(没有修饰的蛋白质的额外表达)。在一个实施方案中，术语“修饰的噬菌体”是指其中至少一种目的基因被抑制的噬菌体。在一个实施方案中，术语“修饰的噬菌体”是指一种目的基因被抑制的噬菌体。
[0013]这样的修饰的噬菌体可用于确定被抑制的噬菌体蛋白质的功能。多种常用的酶来源于噬菌体，例如T4连接酶或多种RNA聚合酶。因此，本方法允许基于敲低和功能测定来表征噬菌体蛋白质。或者，可以以改变宿主特异性的方式修饰噬菌体。噬菌体可以包含不同的蛋白质，每种蛋白质都允许识别不同的宿主。当敲低这些蛋白质之一时，相应的宿主就不能再被感染。
[0014]在具体的实施方案中，修饰包括至少一种蛋白质的敲低和修饰的蛋白质的表达，特别是原始形式被抑制的至少一种蛋白质的修饰形式的表达。
[0015]因此，在一个具体实施方案中，该方法还包括通过添加编码目的基因的修饰形式的分子来表达至少一种目的基因的修饰形式的步骤。或者或此外，该方法可包括添加由至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质的步骤。
[0016]因此，在一些实施方案中，产生了具有未修饰的基因组但包含修饰的噬菌体蛋白质的噬菌体。
[0017]通常，特异性抑制内源形式的表达的分子抑制目的基因的转录或翻译。编码目的基因的修饰形式的分子可以是核酸分子，例如DNA或RNA分子。在优选的实施方案中，DNA是质粒或PCR产物的形式。
[0018]在具体实施方案中，特异性抑制目的基因的内源形式的表达的分子是与目的基因的内源形式的序列互补的DNA分子。例如，特异性抑制内源形式的表达的分子与目的基因的核糖体结合位点结合。
[0019]在示例性实施方案中，目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。HOC蛋白可以
具有在SEQ ID NO:1中示出的序列。还考虑了具有与SEQ ID NO:1至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少98％相同序列的序列。
[0020]氨基酸序列HOC(SEQ ID NO:1；*代表序列的终止密码子/末端)：
[0021]MTFTVDITPKTPTGVIDETKQFTATPSGQTGGGTITYAWSVDNVPQDGAEATFSYVLKGPAGQKTIKVVATNT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于在无细胞表达系统中生产修饰的噬菌体的方法，包括以下步骤：
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将微生物的细胞裂解物与噬菌体的基因组接触，
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通过添加特异性抑制至少一种目的基因的内源形式的表达的分子来抑制由所述噬菌体的所述基因组编码的所述至少一种目的基因的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤
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通过添加编码所述目的基因的修饰形式的分子来表达所述至少一种目的基因的修饰形式。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤
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添加由所述至少一种目的基因的修饰形式编码的修饰的噬菌体蛋白质。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目的基因是必需基因或非必需基因。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述噬菌体的所述基因组未被修饰。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述目的基因编码所述噬菌体的衣壳蛋白或尾纤维蛋白，优选地其中所述目的基因编码高免疫原性外衣壳蛋白(HOC)。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中修饰的噬菌体蛋白质包含选自由以下组成的组的修饰：亲和标签、检测标记、用于改进所述噬菌体或突变的蛋白质或其组合。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述噬菌体是肌尾噬菌体(Myoviridae)科、优选Tevenvirinae亚科的噬菌体，甚至更优选T4病...

【专利技术属性】
技术研发人员：基里安，
申请(专利权)人：慕尼黑科技大学，
类型：发明
国别省市：