新型β-胡萝卜素氧化酶制造技术

本发明专利技术涉及一种提高用于由β

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型
β
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胡萝卜素氧化酶
[0001]本专利技术涉及一种提高在由β
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胡萝卜素转换生产维生素A醛(视黄醛)中使用的β
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胡萝卜素氧化酶(beta
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carotene oxidase,BCO)，特别是昆虫BCO的反式特异性的方法，其中至少约78％至100％的视黄醛为反式异构体。
[0002]视黄醛是类视黄醇生产方法，特别是诸如维生素A生产方法中的重要中间体/前体。类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫系统和生长方面。
[0003]目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，包括微生物转换步骤，这将更加经济和环保。
[0004]通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不可行的。造成这种情况的原因有一些，包括类视黄醇在此类生物系统中的不稳定性或副产物的相对高产量。维生素A的不稳定性可以通过产生乙酰化形式(例如视黄基或维生素A乙酸酯)来避免。由于类视黄醇是手性化合物，所以它们以反式形式和顺式形式两者存在。然而，出于工业目的，反式同种型，即反式视黄醇乙酸酯，是最重要的形式。
[0005]从β
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胡萝卜素开始，此类用于生产主要为反式同种型的维生素A/维生素A乙酸酯的生物学方法中的第一步骤由BCO催化，从而产生两个单位的视黄醛。在已知的BCO酶中，昆虫BCO由于其高酶促活性，即β
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胡萝卜素几乎完全转换为视黄醛(高达95％的转化率)，而特别受关注。然而，它们不是完全反式特异性的，意味着它们产生了一定水平的顺式视黄醛，所述顺式视黄醛无法再转换为反式视黄醇乙酸酯(VitA乙酸酯)。这导致了至所需的反式视黄醇乙酸酯产物的碳通量的损失。
[0006]因此，提高β
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胡萝卜素酶促转换为维生素A的生产率和/或选择性或特异性是一项持续进行的任务，包括改进第一酶促步骤，即β
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胡萝卜素酶促转换成反式视黄醛。具体地，期望通过增加反式特异性来优化高活性酶，例如已知的来自昆虫的高活性酶，所述反式特异性导致主要是反式视黄醛，所述反式视黄醛进而转换为反式视黄醇乙酸酯。
[0007]令人惊讶地，我们现在发现β
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胡萝卜素氧化酶中，特别是显示出反式活性和顺式活性两者的昆虫BCO中的某些氨基酸的修饰，可以促进反式视黄醛的形成，即增加立体选择性，而不会对BCO的生产率产生任何实质性损害，从而导致转换率在基于在相应宿主细胞中存在/产生的包括视黄醛在内的总类视黄醇，至少约78％的反式同种型的范围中。
[0008]因此，本专利技术涉及经修饰的(反式选择性)BCO酶，特别是昆虫酶，所述酶可以在合适的宿主细胞，例如产生类胡萝卜素/类视黄醇的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞中表达，具有催化β
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胡萝卜素转换成反式视黄醛的活性，其中基于在宿主细胞中存在/由宿主细胞产生的总类视黄醇，反式视黄醛的百分比在至少约78％，例如约80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至100％的范围中。优选地，待根据本专利技术进行修饰的未修饰的BCO酶来源于果蝇(Drosophila)，例如黑腹果蝇(D.melanogaster)。具体地，经修饰
的BCO的活性，即将β
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胡萝卜素到视黄醛的转换率，在至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％至约100％的范围中，即与相应的未修饰的BCO大致相同。
[0009]具体地，本专利技术涉及经修饰的BCO酶，优选经修饰的昆虫BCO，更优选来源于果蝇，例如黑腹果蝇的昆虫BCO，即经修饰的BCO，所述经修饰的BCO包含一个或多个修饰，即氨基酸取代，优选地包含在序列中的一个或多个氨基酸取代，所述序列与SEQ ID NO:1具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、或直至100％的同一性，其中所述一个或多个氨基酸取代位于与在根据SEQ ID NO:1的多肽中的选自91位和/或499位的氨基酸残基对应的位置处。
[0010]术语经修饰的“β
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胡萝卜素氧化酶”、“β
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胡萝卜素氧化酵素”、“β
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胡萝卜素加氧酶”、“具有β
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胡萝卜素氧化活性的酶”或“BCO”在本文中可互换使用，并且是指β
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胡萝卜素15,15'
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双加氧酶(EC1.13.11.63)，有时也指β
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胡萝卜素15,15'
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单加氧酶(EC1.14.99.36)，所述酶能够催化β
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胡萝卜素转换成两个单位的视黄醛，其中至少约78％至100％为反式视黄醛并且总转换率(即，酶活性)是至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％至约100％，即其中至少约5％的β
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胡萝卜素转换成了视黄醛。此类经修饰的BCO在本文中被称为反式选择性酶。优选的经修饰的同种型是与SEQ ID NO:1具有至少60％同一性的多肽，所述多肽包含在如本文所定义的一个或多个位置上的一个或多个氨基酸取代。
[0011]与β
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胡萝卜素的酶促催化相关的术语“转换”、“酶促转换”、“氧化”、“酶促氧化”或“切割”在本文中可互换使用，并且是指如本文所定义的经修饰的BCO的作用。
[0012]如本文所用，关于经修饰的BCO的术语“立体选择性”、“选择性”、“反式选择性”酶在本文中可互换使用。它们是指具有增强的反式同种型催化活性，即增强的朝向将β
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胡萝卜素催化成反式视黄醛的活性的酶，即如本文所公开的经修饰的BCO。根据本专利技术的经修饰的酶是反式特异性的，如果反式同种型(例如反式视黄醛)的百分比在基于总类视黄醇，至少约78％的范围中，所述总类视黄醇包括由此类经修饰的酶或包含和表达此类经修饰的酶的此类产生胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞产生的视黄醛。
[0013]术语“转换率”是指反式形式的百分比，即在包含化合物的顺式形式和反式形式的混合物中存在的反式形式的比率，特别是包括反式视黄醛的反式形式的类视黄醇与例如存在于相应宿主细胞中的包括视黄醛在内的总类视黄醇的比率，其中反式选择性是由本专利技术的经修饰的BCO酶的作用产生的。
[0014]如本文所用，术语“真菌宿主细胞”尤其包括酵母作为宿主细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)或酵母属(Saccharomyces)。
[0015]如本文所定义的经修本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种β
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胡萝卜素氧化酶，优选昆虫酶，更优选来源于果蝇的酶，所述酶在序列中包含一个或多个氨基酸取代，所述序列与SEQ ID NO:1具有至少约60％，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或直至100％的同一性，其中所述一个或多个氨基酸取代位于与根据SEQ ID NO:1的多肽中的选自91和/或499的氨基酸残基对应的位置处，并且其中残基91的氨基酸是色氨酸或苯丙氨酸，和/或残基499的氨基酸选自甲硫氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的酶，所述酶催化β
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胡萝卜素转换成视黄醛，其中基于总类视黄醇，至少约78％的比率为反式视黄醛。3.根据权利要求1或2所述的酶，其中至少约5％的β
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胡萝卜素被转换成视黄醛。4.根据权利要求1至3中任一项所述的酶，其中与不携带所述氨基酸取代中的一个或多个氨基酸取代的相应酶的反式特异性相比，基于总类视黄醇，朝向包括形成反式视黄醛的反式同种型的特异性增加了至少约7％。5.根据权利要求1至4中任一项所述的酶，所述酶包含单个氨基酸取代，所述单个氨基酸取代位于与根据SEQ ID NO:1的多肽中选自91和/或499，优选选自残基499的氨基酸残基对应的位置处。6.根据权利要求1至5中任一项所述的酶，所述酶包含在与根据SEQ ID NO:1的多肽中选自91和499的氨基酸残基对应的位置处的至少两个氨基酸取代。7.根据权利要求1至6中任一项所述的酶，所述酶在产生类胡萝卜素的宿主细胞中表达，所述产生类胡萝卜素的宿主细胞优选为真菌宿主细胞，更优选选自耶氏酵母属或酵母属。8.一种产生类胡萝卜素的宿主细胞，特别是真菌宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1至7中任一项所述的酶，其中所述宿主细胞优选选自耶氏酵母属或酵母属，并且用表达所述酶的多核苷酸转化。9.一种用于生产反式视黄醛的方法，所述方法包括提供根据权利要求8所述的产生类胡萝卜素的宿主细胞；在合适的培养条件下在合适的培养基中培养所述宿主细胞；以及任选地从所述培养基中分离和/或纯化所述反式视黄醛，其中所述反式视黄醛的比率在基于总类视黄醇至少约78％的范围中。10.一种用于使产生类胡萝卜素的宿主细胞中β
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胡萝卜素至反式视黄醛的转换率提高基于总类视黄醇至少7％的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：