使用人工微RNA修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成制造技术

本发明专利技术提供了用于培养哺乳动物细胞的稳定遗传修饰的方法和组合物。遗传修饰可用于产生用于治疗或诊断目的的培养的哺乳动物细胞。生用于治疗或诊断目的的培养的哺乳动物细胞。生用于治疗或诊断目的的培养的哺乳动物细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用人工微RNA修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成
对相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2019年5月13日提交的62/846847、2019年7月3日提交的62/870321、2020年2月25日提交的62/981417和2020年5月4日提交的63/019733的益处，通过引用将其全部合并用于所有目的。对序列表的引用
[0002]本申请涉及在名为SEQ_DN20200502_ST25的txt文件中公开的序列，该文件为1,070,000字节，创建于2020年5月2日，通过引用并入。
2.
技术介绍

[0003]将异源核酸引入哺乳动物细胞可用于改变它们的特性，以及它们产生的分子的特性。培养的哺乳动物细胞的可遗传修饰特性包括培养的哺乳动物细胞分泌的蛋白质的糖基化、培养的哺乳动物细胞产生的蛋白质的蛋白水解加工、细胞产生的蛋白质的细胞内运输、包括哪些营养素必须从外部提供给细胞的细胞生长特性，以及细胞在包括高水平异源蛋白表达在内的各种压力下对细胞凋亡的存活率和敏感性。免疫细胞的可遗传修饰特性包括免疫细胞识别的分子、免疫细胞内的细胞反应、免疫细胞在某些环境条件(包括通常导致细胞死亡、无反应性、或衰竭的条件)下存活和执行免疫功能的能力，以及免疫细胞产生的蛋白质。
[0004]哺乳动物细胞的稳定遗传修饰可以通过将异源多核苷酸整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中来进行。异源DNA可以通过不同方式导入细胞：通过用裸露的质粒DNA转染，通过将DNA包装成用于感染培养的哺乳动物细胞的病毒颗粒，或通过用转座子及其相应的转座酶转染细胞。
[0005]非病毒载体系统，包括质粒DNA，由于缺乏基因组插入和导致转染细胞群中载体的降解和/或稀释，经常遭受细胞传递效率低下、细胞毒性和转基因表达持续时间有限的问题。通过非病毒方法传递的转基因通常形成长的、重复的阵列(串联体)，这些阵列是异染色质形成转录沉默的目标。
[0006]病毒包装通常对可以插入的DNA的大小施加限制。还有关于病毒整合位点的安全问题，以及病毒制造的成本和复杂性。
[0007]在整合到细胞基因组中的多核苷酸上编码的基因的表达水平取决于多核苷酸内序列元件的构型。整合效率、整合到每个基因组中的多核苷酸拷贝数以及发生整合的基因组基因座也影响多核苷酸上编码基因的表达水平。通过将多核苷酸置于转座子中，通常可以提高多核苷酸整合到靶细胞基因组中的效率。转座子包含被转座酶识别的两个末端。转座酶作用于转座子，将其从一个DNA分子中切除并将其整合到另一个分子中。两个转座子末端之间的DNA与转座子末端一起被转座酶转座。侧翼为一对转座子末端以使其被转座酶识别和转座的异源DNA在本文中称为合成转座子。将合成转座子和相应的转座酶引入真核细胞的细胞核可能会导致转座子转座到细胞的基因组中。转座子/转座酶基因传递平台有可
能克服裸露DNA和病毒传递的局限性。PiggyBac
‑
like转座子因其无限的基因载货容量而具有吸引力，但Mariner转座子(如Sleeping Beauty，睡美人)或hAT转座子(如TcBuster)也提供了将异源DNA整合到哺乳动物细胞基因组中的有效方法。
[0008]通过抑制哺乳动物细胞的内源基因，可以有利地改变哺乳动物细胞的特性。RNA干扰方法可用于抑制内源性哺乳动物细胞基因，以有利地改变哺乳动物细胞的特性。RNA干扰是抑制哺乳动物细胞内源基因的一项有前途的技术。目前使用的技术受到限制，无法可靠地长期抑制基因表达。一种广泛使用的技术是用siRNA处理免疫细胞，通过siRNA转染或通过化学修饰的siRNA处理。这可用作确定基因抑制或基因敲除的表型效应的实验技术。然而，RNA是不稳定的，因此作为RNA给药的siRNA的任何影响都是暂时的。第二种技术是转染编码shRNA的基因，该基因与RNA聚合酶III转录的启动子可操作地连接。这种技术经常受到单个shRNA分子的可变效力以及随机整合的高度可变速率的限制。使用慢病毒载体可以解决随机整合的可变速率，但shRNA功效的可变性仍然存在很大问题(Anastasov et.al.,2009.J.Hematop 2,9
‑
19.“Efficient shRNA delivery into B and T lymphoma cells using lentiviral vector
‑
mediated transfer”)。
[0009]microRNAs(miRNAs)是天然存在的RNA，其通过RNA聚合酶II从它们的基因转录。microRNAs包括分子内双链RNA发夹，由细胞酶加工产生与一个或多个mRNA靶标互补的“向导链”。向导链与RISC复合体物理上相关联，通过RISC复合体抑制靶mRNA的表达。人工miRNAs(amiRNAs)可以通过使用天然支架进行设计，并对其进行调整以产生抑制天然靶标以外的靶标的向导链。人工miRNAs也可以被RNA聚合酶III转录(Snyder et.al.,2009.Nucl.Acids Res.37 e127 doi:10.1093/nar/gkp657.“RNApolymerase III can drive polycistronic expression of functional interfering RNAs designed to resemble microRNAs”)。miRNA支架的使用可以改善干扰RNAs的处理，但有效性的可变性仍然是一个挑战。因此，本领域需要一种稳健的RNA干扰方法来抑制哺乳动物细胞的内源基因，以改变哺乳动物细胞或哺乳动物细胞产生的蛋白质或其它化合物的特性。
[0010]为了实现有利的表型变化，本文公开了用于将包括人工microRNAs的多核苷酸引入哺乳动物细胞以抑制哺乳动物细胞内源性基因的方法和组合物。
3.
技术实现思路

[0011]描述了修饰哺乳动物细胞基因组以抑制内源基因表达的方法。哺乳动物细胞可以包括为生产表达的蛋白质而培养的哺乳动物细胞。它们还可包括免疫细胞，包括淋巴细胞，例如T细胞和B细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞)、T辅助细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。
[0012]RNA干扰方法可用于抑制内源性哺乳动物细胞基因的表达以有利地改变哺乳动物细胞的特性。在这里，我们描述了提高RNA干扰效率的方法：(i)表达干扰RNA的基因(例如shRNA或amiRNA基因)可以整合到转座子中，其中所述转座子的一个或多个拷贝被整合到哺乳动物细胞基因组的转录活性区域中，以及(ii)所述干扰RNA包含与同一mRNA靶标内的两个或多个不同序列互补的两个或多个不同的向导链。在慢病毒载体或转座子载体中提供与同一mRNA靶标内的不同序列互补的两条或多条向导链，大大提高了RNA干扰的可靠性。
[0013]描述了设计用于抑制哺乳动物细胞中表达的基因的多核苷酸的方法。用于抑制靶
基因(“抑制性基因转移多核苷酸”)的优选基因转移多核苷酸包括两个或多个不同的发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多核苷酸，包括a)编码多发夹amiRNA序列的片段，其中所述片段包括：
ⅰ
)包含与天然哺乳动物细胞mRNA的第一靶位点完全互补的连续19个核苷酸序列的第一向导链序列以及包含与所述第一向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸；
ⅱ
)包含连续的19个核苷酸序列的第二向导链序列，所述连续的19个核苷酸序列与不同于与所述第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA的所述第一靶位点的第二靶位点完全互补，以及包含与所述第二向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同；和b)在哺乳动物细胞中有活性并且由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录的真核启动子，其可操作地连接到编码所述amiRNA序列的片段，其中所述amiRNA序列可被表达并折叠成多个发夹。2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19
‑
22个核苷酸序列，并且所述第一过客链序列与所述第一向导序列长度相同。3.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19
‑
22个核苷酸序列，并且所述第一过客链序列比所述第一向导序列短。4.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二靶位点不重叠。5.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述多发夹amiRNA序列的所述片段进一步包括第三向导链序列和第三过客链序列，所述第三向导链序列包含与所述第一和第二向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19个核苷酸序列，所述第三过客链序列包含与所述第三向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列，其中所述第三向导链和第三过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。6.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，进一步包括两个位于所述片段和所述启动子侧翼的转座子末端，其中所述片段和所述启动子可被相应的转座酶转座。7.权利要求6所述的多核苷酸，其中每个转座子末端包括选自SEQ ID NOs：1004和1005、或SEQ ID NOs：1010和1011、或SEQ ID NOs：1014和1015、或SEQ ID NOs：1016和1017、或SEQ ID NOs：1022和1023、或SEQ ID NOs：1026和1027、或SEQ ID NOs：1030和1031、或SEQ ID NOs：1036和1037、或SEQ ID NOs：1040和1041、或SEQ ID NOs：1044和1045、或SEQ ID NOs：1112和1113的序列。8.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，进一步包括与所述启动子可操作地连接的开放阅读框，其中所述多发夹amiRNA序列从所述开放阅读框后的3'UTR中的启动子表达。9.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述开放阅读框编码选择标记。10.权利要求9所述的多核苷酸，其中所述开放阅读框编码荧光蛋白。11.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述选择标记通过允许细胞合成代谢有用的物质或在有害物质如抗生素、酶抑制剂或细胞毒物存在下存活，为细胞提供生长优势。12.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述选择标记选自二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合
成酶、氨基糖苷3'
‑
磷酸转移酶、嘌呤霉素乙酰转移酶、杀稻瘟素乙酰转移酶、杀稻瘟素脱氨酶、潮霉素B磷酸转移酶或zeocin结合蛋白。13.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是EF1a启动子、来自巨细胞病毒的即刻早期基因1、2或3的启动子、真核延伸因子2的启动子、3
‑
磷酸甘油醛脱氢酶启动子、肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶启动子、泛素启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子或猿猴病毒40启动子。14.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个过客链序列在对应于所述向导链序列的第一个碱基的位置与其对应的向导链序列不互补。15.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个过客链序列在对应于所述向导链序列第十二个碱基的位置与其对应的向导链序列不互补。16.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中向导链序列与其对应的过客链序列之间的每个5
‑
35个核苷酸的非结构化环序列包含选自SEQ ID NOs：683
‑
692的序列。17.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个向导链
‑
过客链发夹进一步包括紧邻所述发夹的5'和3'的附加序列，其中所述附加序列是SEQ ID NO:697到5'和SEQ ID NO:698到3'，或SEQ ID NO:699到5'和SEQ ID NO:700到3'，或SEQ ID NO:701到5'和SEQ ID NO:702到3'，或SEQ ID NO:703到5'和SEQ ID NO:704到3'，或SEQ ID NO:705到5'和SEQ ID NO:706到3'，或SEQ ID NO:709到5'和SEQ ID NO:710到3'，或SEQ ID NO:711到5'和SEQ ID NO:712到3'，或SEQ ID NO:713到5'和SEQ ID NO:714到3'。18.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被整合到哺乳动物细胞的基因组中。19.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，编码mRNA的靶基因的表达、或mRNA或由其表达的蛋白质的功能或活性被所述多核苷酸有效地降低至低于在基因组不包含所述多核苷酸的对照哺乳动物细胞中的20％。20.权利要求18所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞是仓鼠细胞。21.权利要求18所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞是初级免疫细胞。22.一种哺乳动物细胞，包含前述权利要求中任一项的多核苷酸。23.权利要求23中所述的哺乳动物细胞，其中与基因组不包含所述多核苷酸的等效哺乳动物细胞相比，所述靶基因的表达或所述靶基因产物的功能或活性降低至其正常水平的20％以下。24.权利要求1
‑
21中任一项所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码催化直接或间接影响细胞产生的蛋白质糖基化的反应的酶。25.权利要求24所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码岩藻糖基转移酶、GDP
‑
甘露糖脱水酶或GDP
‑
岩藻糖转运蛋白。26.权利要求24所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ ID NOs：1
‑
9的序列至少98％相同的序列。27.权利要求26所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs：75
‑
80，或SEQ ID NOs：81
‑
86，或SEQ ID NOs：87
‑
92，或SEQ ID NOs：93
‑
98，或SEQ ID NOs：99
‑
101，或SEQ ID NOs：102
‑
104。28.权利要求26所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自SEQ ID NO:725
‑
736的序
列。29.权利要求1
‑
21中任一项所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞mRNA编码直接或间接影响细胞产生的蛋白质的细胞内分选的蛋白质。30.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码prosaposin或sortilin。31.权利要求30所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ ID NOs：10
‑
11的序列至少98％相同的序列。32.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs：105
‑
107或SEQ ID NOs：108
‑
110。33.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自SEQ ID NOs：737
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰里米，
申请(专利权)人：DNA二零股份有限公司，
类型：发明
国别省市：