本发明专利技术提供了一种提高补体依赖性细胞毒性分析灵敏度的方法，所述方法确定潜在移植受体患者是否表达会减少或阻止受体接受供体器官的供体器官反应性抗体。至少一种编码补体抑制剂的基因在来自候选移植器官的细胞中失活。这样的修饰细胞，由于不再产生至少一种补体抑制剂，当置于来自潜在移植受体的血清样本中时，不会降低血清补体的有效活性。较低水平的受体患者血清抗体在诱导供体细胞的可检测裂解方面变得有效。解方面变得有效。解方面变得有效。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增加细胞对补体介导裂解的敏感性的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年3月21日提交的题为“METHOD FOR INCREASING CELL SUSCEPTIBILITY TO COMPLEMENT
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MEDIATED LYSIS”的美国临时专利申请第62/821,641号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含创建于2020年3月18日的题为“2221042940_ST25”的以电子形式ASCII.txt文件提交的序列表。该序列表的全部内容以其整体并入本文。
技术介绍
[0005]异种器官移植(移植来自不同物种的供体的器官、组织和细胞)可以有效地解决人类供体胰腺的短缺。异种移植的优势还在于：(i)在可预测的、非紧急基础上提供；(ii)在受控环境中生产；以及(iii)在移植前可进行特征分析和研究。
[0006]根据供体和受体物种之间的关系，异种移植可以描述为一致的或不一致的。一致物种是系统发育上密切相关的物种(例如，小鼠与大鼠)。不一致物种是非密切相关的物种(例如，猪与人)。由于猪与人在解剖学和生理学方面有许多相似特征，在大多数研究中，猪一直是异种移植领域的焦点。猪也具有相对短的妊娠期，可以在无病原体的环境中繁殖，而且可能不会出现与不常作为食物来源的动物(如灵长类动物)相关的伦理问题。在过去十年中，猪到灵长类动物异种移植领域的科学知识和专业技术迅速增长，导致拯救生命的猪异种移植物的灵长类动物受体的存活时间显著延长。(Cozzi等人，异种器官移植16：203
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214.2009)。
[0007]异种移植排斥反应可分为三个阶段：超急性排斥反应、急性体液性异种移植排斥反应和T细胞介导的细胞排斥反应。超急性排斥反应(HAR)是一种非常快速的事件，其在移植物再灌注后数分钟至数小时内导致不可逆的移植物损伤和损失。它是由移植时受者体内存在的异种天然抗体触发的。人类具有天然存在的针对猪细胞上发现的1，3
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半乳糖(Gal)表位的抗体。该抗体以高量产生，并且是HAR的主要介质。将猪细胞中的1，3
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半乳糖(Gal)表位作为GT(半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO))进行遗传去除，导致GTKO猪不会发生HAR。
技术实现思路
[0008]本公开的一个方面涵盖一种检测患者体内移植供体器官反应性抗体方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对动物或人类器官的细胞群进行遗传修饰，减少至少一种补体抑制剂的表达；(b)将遗传修饰的细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的所述患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官且未经遗传修饰的细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。
[0009]在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以来自候选移植器官。
[0010]在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以是供体淋巴细胞。
[0011]在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以来自肾脏。
[0012]在本公开的该方面的一些实施例中，所述细胞群可以是肾内皮细胞。
[0013]在本公开的该方面的一些实施例中，该方法可以进一步包括：(i)从所述器官获得组织样本；以及(ii)产生遗传修饰的器官衍生细胞群，该器官衍生细胞群包括通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述细胞而产生的非活性补体抑制剂编码基因，其中，所述向导RNA对补体抑制剂具有特异性。
[0014]在本公开的该方面的一些实施例中，所述非活性补体抑制剂编码基因可以选自由CD46、CD55和CD59组成的组。
[0015]在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46。
[0016]在本公开的该方面的一些实施例中，所述使非活性补体抑制剂编码基因失活的向导RNA，包括从SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组成的组中选择的核苷酸序列，以及从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0017]在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂是CD46类，并且在生理条件下，与SEQ ID NO：19序列或其补体杂交并基于CRISPR Cas9失活的向导RNA具有SEQ ID NO：20核苷酸序列。
[0018]在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体是质粒PX330或PX458，并且当所述质粒转染到哺乳动物细胞中时，所述表达质粒表达Cas9。
[0019]在本公开的该方面的一些实施例中，所述表达载体包括与从SEQ ID No：13至SEQ ID No：18组成的组中选择的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列。
[0020]本公开的另一方面涵盖一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法的实施例，所述方法包括以下步骤：(a)通过对候选动物或人类移植供体肾脏的肾内皮细胞群进行遗传修饰，减少所述细胞群的至少一种补体抑制剂的表达，其中，所述遗传修饰通过以下步骤进行：(i)从肾脏获得组织样本；以及(ii)产生包含非活性CD46补体抑制剂编码基因的遗传修饰的肾衍生细胞群，所述非活性CD46补体抑制剂编码基因是通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述肾内皮细胞而产生的，其中，所述向导RNA对所述补体抑制剂CD46具有特异性，并且包含从SEQ ID NO：l和SEQ ID NO：7组成的组中选择的核苷酸序列，和与从SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中，所述表达载体包含与选自SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列；(b)将遗传修饰的肾内皮细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰的肾内皮细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官并且未经遗传修饰的肾内皮细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。
[0021]本公开的另一个方面是一种经遗传修饰的哺乳动物细胞，其中，所述细胞来自供体组织，其中，所述细胞经遗传修饰具有减少的补体抑制剂表达或不具有补体抑制剂表达。
[0022]在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46、CD55或CD59。
[0023]在本公开的该方面的一些实施例中，所述补体抑制剂可以是CD46类、CD46本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过对动物或人类器官的细胞群进行遗传修饰，减少至少一种补体抑制剂的表达；(b)将遗传修饰的细胞群与从期望接受移植供体器官的患者分离出的血清样本接触；以及(c)检测所述遗传修饰的细胞群的裂解，其中，裂解指示期望接受所述移植供体器官的所述患者是否表达供体器官反应性抗体，其中，当与来自所述器官且未经遗传修饰的细胞群比较时，所述裂解可被检测或增加，以减少至少一种表达的补体抑制剂。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群来自候选移植器官。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群是供体淋巴细胞。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞群来自肾脏。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细胞群是肾内皮细胞。6.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)还包括：(i)从所述器官获得组织样本；以及(ii)产生遗传修饰的器官衍生细胞群，该器官衍生细胞群包括通过用至少一种编码向导RNA和CRISPR Cas9的表达载体转染所述细胞而产生的非活性补体抑制剂编码基因，其中，所述向导RNA对补体抑制剂具有特异性。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述非活性补体抑制剂编码基因选自CD46类、CD46、CD55和CD59。8.如权利要求6所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，其核苷酸序列编码与SEQ ID NO：19的核苷酸序列具有至少90％的相似性。9.如权利要求6所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，其氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO：23具有至少90％的相似性。10.如权利要求1所述的方法，其中，所述使非活性补体抑制剂编码基因失活的向导RNA包括从SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组成的组中选择的核苷酸序列，以及从SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12组成的组中选择的核苷酸序列互补的核苷酸序列。11.如权利要求9所述的方法，其中，所述补体抑制剂是CD46类，并且在生理条件下，与SEQ ID NO：19序列或其补体杂交并基于CRISPR Cas9失活的向导RNA具有SEQ ID NO：20核苷酸序列。12.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达载体是质粒PX330或PX458，并且当所述质粒转染到哺乳动物细胞中时，所述表达质粒表达Cas9。13.如权利要求6所述的方法，其中，所述表达载体包括与从SEQ ID NO：13至SEQ ID NO：18组成的组中选择的核苷酸序列具有至少85％相似性的核苷酸序列。14.一种患者体内移植供体器官反应性抗体的检测方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过对候选动物或人类移植供体肾脏的肾内皮细胞群进行遗传修饰，减少所述细胞群的...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔，
申请(专利权)人：UAB研究基金会，
类型：发明
国别省市：
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