一种发酵食品的组合菌剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种发酵食品的组合菌剂及其应用，属于微生物技术领域。本发明专利技术设计了适用于郫县豆瓣蚕豆醅的复合发酵菌剂，通过等比例并按顺序依次接种乳酸片球菌，肉葡萄球菌和易变假丝酵母，使郫县豆瓣发酵所产生的风味化合物数量可达到原位发酵的63.1％，风味化合物的种类也较为相似，氨基酸态氮水平达到0.45g/100g，远超GB 2718

【技术实现步骤摘要】
一种发酵食品的组合菌剂及其应用


[0001]本专利技术涉及一种发酵食品的组合菌剂及其应用，属于微生物


技术介绍

[0002]数千年来，发酵食品已成为全球餐桌的重要组成部分。发酵食品通过提供维生素、矿物 质、卡路里和其他营养物质等参与肠道微生物组的组装，并将底物转化为生物活性或生物可 利用的终产物，而其中的部分终产物具有抗高血压、抗癌、抗炎、抗糖尿病、抗血栓形成和 抗动脉粥样硬化等功能。然而，大多数发酵食品都是开放式发酵，这种发酵方式一个重要特 点就是不可控。这导致了许多问题，例如发酵过程中的环境微生物入侵导致有害化合物的产 生。而人工构建的组合菌剂的引入将有可能解决产品均一性、安全性等一系列问题。
[0003]目前郫县豆瓣发酵菌剂的使用多在制曲阶段，通过菌剂中微生物的添加辅助原料降解， 从提供底物的角度出发使得更充分地产生风味化合物。然而，郫县豆瓣蚕豆醅是以曲料与盐 水混合，发酵制成的，在混合之后，曲料中所含有的微生物大多无法适应高盐环境。因此， 在郫县豆瓣蚕豆醅发酵过程中，直接对风味产生有直接作用的微生物大多来自于环境微生物， 而环境微生物受到各种环境因素的影响，进入郫县豆瓣蚕豆醅的环境微生物的不稳定导致最 终发酵蚕豆醅的不稳定，易感染有害物质。
[0004]以郫县豆瓣为代表的传统发酵食品行业正面临工业化改造，改造过程中一个重要的特征 就是使用固定的发酵装置和发酵菌剂进行发酵，以保证产品的稳定性。因此，亟待开发适用 于郫县豆瓣的发酵菌剂。

技术实现思路

[0005]为了解决目前存在的发酵食品天然发酵导致的有害微生物入侵和有害物质的产生问题， 本专利技术通过对发酵食品的天然暴露发酵的发酵菌剂做出了改进，提供了一种自下而上理性构 建的以乳酸片球菌，肉葡萄球菌，易变假丝酵母依次等比例接种的合成微生物菌剂。
[0006]本专利技术提供了一种组合菌剂，含有乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母。
[0007]在一种实施方式中，所述组合菌剂中，乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母的数量 比为1:1:1。
[0008]在一种实施方式中，所述组合菌剂中的乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母的数量 ≥1
×
107CFU/mL或≥1
×
107CFU/g。
[0009]在一种实施方式中，所述组合菌剂是将乳酸片球菌、肉葡萄球菌和/或易变假丝酵母在合 成培养基中培养获得的；所述合成培养基含有：磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾3g/L、葡萄 糖4.5g/L、果糖1.98g/L、甘露醇0.91g/L、阿拉伯糖1.8g/L、苏氨酸0.84g/L、异亮氨酸0.80.84 g/L、亮氨酸1.38g/L、苯丙氨酸0.81g/L、甘氨酸0.51g/L、丙氨酸1.06g/L、赖氨酸1.53g/L、 组氨酸0.06g/L、精氨酸1.73g/L、蛋氨酸0.25g/L、丝氨酸0.15g/L、脯氨酸0.81g/
假丝酵母和乳酸片球菌双菌合成菌群的风味组成；(D)不同双菌合成接种顺序的主要坐标分 析；(E)易变假丝酵母和乳酸片球菌组成的双菌合成菌群的不同接种序列的风味计数；(F) 易变假丝酵母和乳酸片球菌组成的双菌合成菌群不同接种顺序的风味组成。
[0022]图4为微生物两两相互作用图。
[0023]图5为不同规模菌群产生的风味种类构成。(A)不同菌群规模产生的风味数量统计；(B) 空白对照的风味种类构成；(C)鲁氏接合酵母2.1522单菌产生的风味种类构成；(D)鲁氏 接合酵母2.1522和乳酸片球菌双菌产生的风味种类构成；(E)鲁氏接合酵母2.1522、乳酸片 球菌、肉葡萄球菌三菌合成菌群产生的风味种类构成。
[0024]图6为组合菌剂固态模拟发酵与原位发酵的风味对比；(A)组合菌剂模拟发酵和原位发 酵样品的风味化合物数量；(B)组合菌剂模拟发酵与原位发酵样品的共有与特有风味韦恩图； (C)组合菌剂固态模拟发酵、空白对照、原位发酵体系pH；(D)组合菌剂固态模拟发酵、空 白对照、原位发酵体系氨基酸态氮含量柱状图。
具体实施方式
[0025]实施例1组合菌剂的微生物筛选
[0026]首先将天然发酵样品的风味成分作为评价标准。使用不同筛选条件从复杂的群落中选择 目标菌株。然后，在全合成培养基中进行单菌发酵，以确定不同菌株的特性。并根据菌株的 功能进行双菌株发酵。根据单菌株和双菌株发酵的功能性能以及微生物相互作用情况，建立 具有三种或更多微生物的微生物群落。进行固态发酵评价合成菌群的实际发酵效果，最终构 建了以乳酸片球菌，肉葡萄球菌，易变假丝酵母依次等比例接种的组合菌剂。具体步骤包括：
[0027](1)目标微生物种属选择与合成培养基的设计
[0028]以相对丰度、频率和特征向量中心作为目标微生物属的筛选指标。为了选择目标微生物 属中的重要微生物种，我们调查了目标微生物属在工业生产中是否存广泛使用的微生物种/ 株，存在则以该种/株代表该属，若不存在，则根据目标属中丰度最高的OTU序列的比对结 果选择对应的种。然后，根据GRAS和相关报道，过滤了致病微生物，从而获得郫县豆瓣蚕 豆醅中潜在的在风味形成中起重要作用的核心微生物(图1)，包括易变假丝酵母、乳酸片球 菌、戊糖片球菌、肉葡萄球菌、融合魏斯氏菌、鲁氏接合酵母、副乳假单胞菌、可变盐单胞 菌。
[0029]此外，由于原位发酵系统不稳定、易污染、发酵周期长等因素，参考原位发酵的营养组 成设计了一种可在实验室进行，满足所有目标微生物生长代谢的全合成培养基(表1)，基于 该培养基进行后续实验。
[0030]表1合成培养基配方
[0031][0032]注：使用0.22微米的滤膜过滤除菌，使用稀盐酸和氢氧化钠溶液调整pH至5.0
[0033](2)目标微生物的单菌特性
[0034]基于全合成培养基实验的发酵条件是通过考虑目标微生物的生长状态和原位环境条件 (常温，pH＝5.0
‑
5.5)来确定的。将筛选获得的的目标微生物(易变假丝酵母、乳酸片球菌、 戊糖片球菌、肉葡萄球菌、融合魏斯氏菌、鲁氏接合酵母、副乳假单胞菌、可变盐单胞菌) 分别在合成培养基上进行发酵，根据培养条件分为20组，分别在pH为5.0，5.5，6.0，6.5， 7.0，温度为30℃，37℃，42℃，50℃的培养条件下发酵48小时，根据发酵液的OD
600
评价 微生物的生长情况。如图2所示，pH(5.0
‑
7.0)和温度(30
‑
37℃)对微生物生长影响不大。但当 温度达到50℃时，微生物生长受到抑制。因此，选择微生物表现出相似生长状态的条件 (pH＝5.0，T＝30℃)作为以下实验的发酵条件。
[0035]构成合成微生物组的微生物菌株特性是后续研究的基础。因此，按如下所属方法检测了 目标微生物在产生的挥发性化合物的组成。
[0036]HS
‑
SPME
‑
Arrow提取样品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合菌剂，其特征在于，含有乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母；所述乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母的数量比为1:1:1。2.根据权利要求1所述的组合菌剂，其特征在于，所述组合菌剂中的乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母的数量≥1
×
107CFU/mL或≥1
×
107CFU/g。3.根据权利要求2所述的组合菌剂，其特征在于，所述组合菌剂是将所述乳酸片球菌、肉葡萄球菌和易变假丝酵母分别培养后的菌液混合制成。4.根据权利要求2所述的组合菌剂，其特征在于，所述组合菌剂是将乳酸片球菌、肉葡萄球菌和/或易变假丝酵母在合成培养基中培养获得的；所述合成培养基含有：磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾3g/L、葡萄糖4.5g/L、果糖1.98g/L、甘露醇0.91g/L、阿拉伯糖1.8g/L、苏氨酸0.84g/L、异亮氨酸0.80.84g/L、亮氨酸1.38g/L、苯丙氨酸0.81g/L、甘氨酸0.51g/L、丙氨酸1.06g/L、赖氨酸1.53g/L、组氨酸0.06g/L、精氨酸1.73g/L、蛋氨酸0.25g/L、丝氨酸0.15g/L、脯氨酸0.81g/L、缬氨酸0.98g/L、谷氨酸2.95g/L、天冬氨酸1.76g/L、酪氨酸0.85g/L、谷氨酰胺0.51g/L、半胱氨酸0.02g/L、EDTA 50mg/L、六水三氯化铁8.3mg/L、氯化锌0.84mg/L、二水合氯化铜0.13mg/L、六水氯化钴0.1434mg/L、硼酸0.1mg/L、四水合氯化锰0.016mg/L、盐酸硫铵1mg/L、核黄素1mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，张丽杰，郑鹏飞，
申请(专利权)人：四川省郫县豆瓣股份有限公司，
类型：发明
国别省市：