一种去除发酵液中乳糖的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术，具体涉及一种去除发酵液中乳糖的方法。本发明专利技术通过CRISPR/Cas9系统编辑宿主基因组鼠李糖操纵子区域，对发酵实验的菌株进行基因编辑，将LacZ基因与LacY基因编辑进入鼠李糖操纵子区域，具体为将鼠李糖操纵子的RhaB基因与RhaA基因替换为LacZ基因与LacY基因，发酵前期过程中LacZ基因与LacY基因不会表达，而在发酵的末期加入鼠李糖，会诱导LacZ基因与LacY基因表达β

【技术实现步骤摘要】
一种去除发酵液中乳糖的方法


[0001]本专利技术属于生物工程技术，具体涉及一种去除发酵液中乳糖的方法。

技术介绍

[0002]近年来利用生物工程技术将乳糖转化为更高附加值的糖类产品也具有很大市场，例如乳果糖( lactulse)、岩藻糖基乳糖( fucosyllactose)、D
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塔格糖( D
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tagatose)、低聚半乳糖( galacto
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oligosaccharides)等。这些产品为大幅提升乳糖的商业附加值提供了可能，因而具有很大的发展潜力。Abramson等证明大肠杆菌中的乳糖透过酶(LacY)能够协助乳糖从培养基进入到细胞质中，但在大肠杆菌体内存在β
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半乳糖苷酶(LacZ)可降解乳糖，因此为维持大肠杆菌胞内高浓度的乳糖，需要敲除LacZ。代谢乳糖基因的敲除导致大肠杆菌发酵后期乳糖残留量过高继而影响纯化效率，增加纯化成本，影响以乳糖为底物发酵的得率。目前生产上去除乳糖的方法大多使用β
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半乳糖苷酶（乳糖酶），然而乳糖酶价格高昂，在去除乳糖的过程中加入乳糖酶，极大的提高了生产成本。

技术实现思路

[0003]乳糖作为很多糖类产品生产的发酵底物，在发酵液中往往会造成乳糖大量残留，在后续纯化工作中需要添加乳糖酶、增加过滤步骤等来去除乳糖。这样不仅会增加纯化成本，还会减少目标产物的得率。本专利技术通过CRISPR/Cas9系统编辑宿主基因组鼠李糖操纵子区域，对发酵实验的菌株进行基因编辑，将LacZ基因与LacY基因编辑进入鼠李糖操纵子区域，具体为将鼠李糖操纵子的RhaB基因与RhaA基因替换为LacZ基因与LacY基因，发酵前期过程中LacZ基因与LacY基因不会表达，而在发酵的末期加入鼠李糖，会诱导LacZ基因与LacY基因表达β
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半乳糖苷酶和透过酶，对残留在罐体中的乳糖进行代谢消耗，减少乳糖残留。
[0004]本专利技术采用如下技术方案：一种去除发酵液中乳糖的方法，利用改造菌发酵乳糖，最后加入鼠李糖诱导，完成发酵液中乳糖的去除；具体的，将改造菌、IPTG（异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖苷）、乳糖添加到发酵罐中，然后进行发酵，最后加入鼠李糖诱导，完成发酵液中乳糖的去除；所述改造菌中，鼠李糖操纵子区域，RhaB基因与RhaA基因替换为LacZ基因与LacY基因。
[0005]本专利技术中，发酵罐中含有发酵培养基，还可以有其他常规乳糖发酵所需物质，比如甘油、蔗糖或者葡萄糖。
[0006]本专利技术中，进行发酵时，温度为30～37℃，时间为40～90h；诱导的时间为1～10h，优选3～8h。
[0007]本专利技术中，改造菌的原始菌为常规乳糖发酵菌且敲除乳糖代谢基因，比如细菌、真菌，优选棒杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、酵母属、埃希氏菌属，尤其是谷氨酸棒杆菌属、黄短杆菌属，最优选敲除β
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半乳糖苷酶(LacZ)的大肠杆菌，即乳糖代谢缺陷的菌株。
[0008]本专利技术中，改造菌的制备方法包括以下步骤：
（1）以pTargetF质粒为模板使用引物pTS
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CP
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F/R、342
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N20
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F/R，分别通过PCR获得线性质粒后连接，再转化感受态细胞，并涂抗性板培养，获得N20
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342质粒；（2）以N20
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342质粒为模板，以N20
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CPF/R为引物，通过PCR获得线性化N20
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342载体片段；（3）以本底菌株基因组为模板，以342
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HL
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F/R、342
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HR
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F/R、lacZ
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CDS
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F/R为引物，分别通过PCR获得上下游同源臂以及LacZY序列；（4）将步骤（3）获得的PCR产物连接后转化感受态细胞，并涂抗性板培养，挑选单克隆提取目标质粒；（5）步骤（4）的目标质粒转入电转感受态菌，然后涂双抗性板培养，选取阳性单克隆菌；（6）将阳性单克隆菌落挑至LB液体试管，加入IPTG和卡那霉素，培养后划线固体平板，挑去除pTargetF质粒的单克隆挑至无抗LB液体试管，培养后划线无抗平板，挑取pCas质粒去除的菌为改造菌。
[0009]具体的，改造菌的制备方法包括以下步骤：（1）以pTargetF质粒为模板使用引物pTS
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CP
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F/R、342
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N20
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F/R，分别通过PCR获得线性质粒后连接，再转化DH5a感受态细胞，并涂抗性板培养，获得N20
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342质粒；（2）以N20
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342质粒为模板，以N20
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CPF/R为引物，通过PCR获得线性化N20
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342载体片段；（3）以E.coli BL21（DE3）基因组为模板，以342
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HL
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F/R、342
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HR
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F/R、lacZ
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CDS
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F/R为引物，分别通过PCR获得上下游同源臂以及LacZY序列；（4）将步骤（3）获得的PCR产物通过Gibson Assembly Master Mix连接后转化DH5a感受态细胞，并涂抗性板培养，挑选单克隆提取目标质粒；（5）步骤（4）的目标质粒转入E.coli BL21（DE3）Y电转感受态菌，然后涂双抗性板培养，选取阳性单克隆菌；（6）将阳性单克隆菌落挑至LB液体试管，加入IPTG和卡那霉素，培养后划线LB固体平板，挑去除pTargetF质粒的单克隆挑至无抗LB液体试管，培养后划线无抗平板，挑取pCas质粒去除的菌为改造菌。
[0010]进一步的，改造菌的制备方法如下：（1）以pTargetF质粒为模板使用引物pTS
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CP
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F/R、342
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N20
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F/R，分别通过PCR获得线性质粒后，通过Gibson Assembly Master Mix连接后转化E.coli DH5a感受态细胞，并涂壮观霉素抗性板培养，然后挑选单克隆摇菌并测序，选择阳性克隆摇菌培养并提取质粒，获得N20
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342质粒；（2）以N20
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342质粒为模板，以N20
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CPF/R为引物，通过PCR获得线性化N20
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342载体片段；（3）以E.coli BL21（DE3）基因组为模板，以342
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HL
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F/R、342
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HR
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F/R、lacZ
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CDS
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F/R为引物，分别通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，利用改造菌发酵乳糖，最后加入鼠李糖诱导，完成发酵液中乳糖的去除；所述改造菌中，鼠李糖操纵子区域，RhaB基因与RhaA基因替换为LacZ基因与LacY基因。2.根据权利要求1所述去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，发酵罐中含有发酵培养基。3.根据权利要求1所述去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，将改造菌、IPTG、乳糖添加到发酵罐中，然后进行发酵，最后加入鼠李糖诱导，完成发酵液中乳糖的去除。4.根据权利要求1所述去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，进行发酵时，温度为30～37℃，时间为40～90h；诱导的时间为1～10h。5.根据权利要求1所述去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，改造菌为改造的乳糖发酵菌且敲除乳糖代谢基因。6.根据权利要求1所述去除发酵液中乳糖的方法，其特征在于，改造菌的制备方法包括以下步骤：（1）以pTargetF质粒为模板使用引物pTS
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CP
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F/R、342
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N20
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F/R，分别通过PCR获得线性质粒后连接，再转化感受态细胞，并涂抗性板培养，获得N20
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342质粒；（2）以N20
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342质粒为模板，以N20
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CPF/R为引物，通过PCR获得线性化N20
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342载体片段；（3）以本底菌株基因组为模板，以342
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HL
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F/R、342
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HR
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F/R、lacZ
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CDS
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F/R为引物，分别通过PCR获得上下游同源臂以及LacZY序列；（4）将步骤（3）获得的PCR产物连接后转化感受态细胞，并涂抗性板培养，挑选单克隆提取目标质粒；（5）步骤（4）的目标质粒转入电转感受态菌，然后涂双抗性板培养，选取阳性单克隆菌；（6）将阳性单克隆菌落...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，化宿南，
申请(专利权)人：黄山同兮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：