一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法技术

本发明专利技术提供一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，本发明专利技术以花豇豆作为植物酶源，采用PEG/硫酸铵盐双水相萃取技术对粗酶液进行分离纯化，在纯化过程中对酯酶的总酯酶活力和蛋白质含量进行测定，通过对PEG分子量及浓度、硫酸铵盐浓度、体系pH等因素的考察，研究对花豇豆酯酶的酶活分配系数、蛋白分配系数、酶活回收率、比酶活和纯化倍数的影响，利用响应面法对酯酶的萃取条件进行优化，建立一种简单可行的花豇豆酯酶纯化方法，为后续的农药残留检测奠定基础。残留检测奠定基础。残留检测奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法


[0001]本专利技术涉及双水相萃取花豇豆酯酶工艺
，具体地，涉及一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法。

技术介绍

[0002]中国农药残留超标现象严重，部分地区农药残留检出率、超标率高达31.68％和15.84％
[1]。食用农药残留超标的农副产品可能引起慢性中毒，导致疾病的产生。随着人们健康意识的不断增强，农药残留检测越来越受到关注。色谱法等传统的农药残留检测方法不适于现场快速检测，而植物酶源的选择是植物酯酶抑制法检验有机磷农药残留的基础。植物酯酶广泛存在于各种作物中，具有来源丰富、取材方便、提取步骤简单快捷、成本低、易于保存等优势，在农残检测方面具有广阔的应用前景。目前大多数研究以小麦、玉米和黄豆作物等作为酶源，基于前期研究工作，进一步扩大酶源的选取范围，对玉米、麦麸、生白芝麻、黑小麦、蚕豆、荞麦、面粉、小麦、小麦仁、大黑豆、青豌豆、扁豆、红芸豆、绿豆和花豇豆15种原料，进行植物酯酶的提取，总酶活力测定比较，筛选出花豇豆酯酶活性最强，更适合用于植物酯酶酶抑制法检测。然而，花豇豆酯酶是亲水性蛋白质，属于羧酸酯水解酶类。从花豇豆中提取的粗酶液中，不仅含有大量的杂蛋白，而且可能同时存在多种酯酶，对于研究花豇豆酯酶的理化性质具有很大的影响，会造成测定结果无法真实反应花豇豆酯酶与有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制作用之间的关系，因此需要对花豇豆酯酶粗酶液进行分离纯化，并且对开发研究新的应用具有十分重要的意义，用纯化后的酯酶进行理化性质的深入研究。
[0003]分离纯化酶通常采用蛋白质的分离纯化法，作为检测有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的关键用酶，研究人员已经开发了几种植物酯酶的纯化方法，然而，几乎所有的纯化方法都涉及大量的步骤。沉淀和离心后，透析用于初始纯化，离子交换层析和凝胶过滤层析用于最终纯化。众所周知，纯化涉及的步骤越多，产品的产量损失就越大，此外，扩大这些方法的规模既困难又昂贵，其纯化步骤的成本占总生产成本的50
‑
90％
[1]。因此，需要一种经济、高效的大规模生物分离纯化方法，以提供具有生物活性的高产率、高纯度的花豇豆酯酶。一种符合所有这些标准的纯化方法是双水相萃取(ATPE)
[2]。
[0004]双水相萃取(aqueous two phase extraction，英文缩写ATPE)技术设备简单、易于操作、条件温和、耗时短，值得注意的是，ATPE技术能够避免传统液
‑
液萃取技术中有机溶剂与活性物质的直接接触，进而对生物活性物质起到保护作用。双水相系统(aqueous two
‑
phase system，英文缩写ATPS)的生物亲和性，能够使得初步纯化后的酶液直接应用于后续的各种研究中，使操作趋于简捷。因此，ATPE技术具有十分广阔的应用前景，尤其是在分离纯化酶的研究中得到了越来越多的关注
[3
‑
5]。
[0005]参考文献：
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740.

技术实现思路

[0011]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的优化方法。
[0012]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0013]根据本专利技术的一个方面，提供一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，包括：
[0014]提取花豇豆酯酶粗酶液；
[0015]建立PEG
‑
硫酸铵双水相系统，并确定成相所需PEG和硫酸铵的初步浓度范围；
[0016]采用3因素3水平的响应面实验法对PEG的浓度、硫酸铵的浓度及体系pH进行优化分析，得到优化后的萃取工艺参数。
[0017]优选地，所述提取花豇豆酯酶粗酶液，包括：花豇豆粉碎后，按质量体积料液比1:4
‑
6，加入提取液pH为7
‑
9的磷酸盐缓冲溶液，置于常温条件下浸提1
‑
3h，过滤，在4℃条件下以7000
‑
9000r/min的速率离心，取上清液，得到粗酶液。
[0018]优选地，所述建立PEG
‑
硫酸铵双水相系统，并确定成相所需PEG和硫酸铵的初步浓度范围，包括：采用浊点法绘制双水相相图。
[0019]优选地，在采用3因素3水平的响应面实验法对PEG的浓度、硫酸铵的浓度及体系pH进行优化分析中，测定指标为花豇豆酯酶纯化倍数。
[0020]优选地，还包括测定总酯酶活力和蛋白含量，根据所述总酯酶活力和所述蛋白含量确定所述纯化倍数。
[0021]优选地，所述采用3因素3水平的响应面实验法对PEG的浓度、硫酸铵的浓度及体系pH进行优化分析，包括：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在于，包括：提取花豇豆酯酶粗酶液；建立PEG
‑
硫酸铵双水相系统，并确定成相所需PEG和硫酸铵的初步浓度范围；采用3因素3水平的响应面实验法对PEG的浓度、硫酸铵的浓度及体系pH进行优化分析，得到优化后的萃取工艺参数。2.根据权利要求1所述的基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在于，所述提取花豇豆酯酶粗酶液，包括：花豇豆粉碎后，按质量体积料液比1:4
‑
6，加入提取液pH为7
‑
9的磷酸盐缓冲溶液，置于常温条件下浸提1
‑
3h，过滤，在4℃条件下以7000
‑
9000r/min的速率离心，取上清液，得到粗酶液。3.根据权利要求1所述的基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在于，所述建立PEG
‑
硫酸铵双水相系统，并确定成相所需PEG和硫酸铵的初步浓度范围，包括：采用浊点法绘制双水相相图。4.根据权利要求1所述的基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在于，在采用3因素3水平的响应面实验法对PEG的浓度、硫酸铵的浓度及体系pH进行优化分析中，测定指标为花豇豆酯酶纯化倍数。5.根据权利要求4所述的基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在于，还包括测定总酯酶活力和蛋白含量，根据所述总酯酶活力和所述蛋白含量确定所述纯化倍数。6.根据权利要求4所述的基于响应面分析的双水相萃取花豇豆酯酶的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守慧，马月琼，魏新林，魏康，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：