一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
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天冬氨酸
β
‑
脱羧酶突变体


[0001]本专利技术涉及一种L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体，属于酶工程


技术介绍

[0002]L
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丙氨酸(L
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Ala)是一种具有重要价值的氨基酸，在日化、食品和医药行业中有着广泛的用途。在食品行业，L
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丙氨酸可以作为添加剂提高饮料中蛋白质的利用率，也可以作为甜味剂提高产品甜度；L
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丙氨酸也可以与谷氨酸钠制备符合调味品，改善食品风味。在医药行业，L
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丙氨酸是合成维生素B6和氨基丙醇的重要中间体。
[0003]目前工业上主要使用生物酶催化法和发酵法制备L
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丙氨酸。虽然发酵法的原料廉价易得，但由于产品光学纯度差、副产物多、提取困难等缺点，生物酶催化法为绿色生产提供了良好的发展前景。
[0004]目前酶催化法合成L
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丙氨酸主要利用天冬氨酸或者富马酸作为催化底物，为进一步降低成本，在申请公开号为CN112941003A的中国专利技术专利申请文本中记载提供了一种新的多酶级联催化路线，以马来酸作为底物进行催化。在多酶级联催化过程中，马来酸顺反异构酶MaiA催化的最适pH为8，天冬氨酸裂解酶AspA催化的最适pH为8.5，天冬氨酸β脱羧酶ASD催化的最适pH为5，为了使三种酶可以更好的协同作用，反应体系的pH值设定在pH 7.5，天冬氨酸β脱羧酶ASD无法发挥最优的催化活性，一定程度上影响了L
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丙氨酸的产量。为了进一步提高L
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丙氨酸的产量，亟需一种在碱性环境下兼具稳定和高活性的天冬氨酸β脱羧酶。
[0005]因此，提供一种酶活在碱性条件下酶活更高稳定性更好的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶、一种高产L
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丙氨酸的方法，对于工业应用生产L
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丙氨酸具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶的最适pH条件为酸性(pH 5.0)，在碱性条件(pH 7.5)下催化活性较低。本专利技术通过对其进行基因突变，构建得到一个在碱性条件下酶活提高且稳定性提高的突变体E88R。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示列。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供携带所述基因，或所述载体的细胞。
[0012]本专利技术的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达上述L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET28a。
[0016]本专利技术的第六个目的是提供一种提高L
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天冬氨酸β
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脱羧酶稳定性的方法，所述方法是将将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶的第88位谷氨酸突变为精氨酸。
[0017]本专利技术的第七个目的是提供一种提高L
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丙氨酸产量的方法，所述方法为以上述基因工程菌为出发菌株，以马来酸为底物，发酵生产L
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丙氨酸。
[0018]本专利技术的第八个目的是提供一种生产所述L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体的方法，将上述基因工程菌接种于培养基中，35～38℃培养至OD
600
为0.6
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0.8时，加入诱导剂IPTG于20
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22℃诱导16
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18h。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，35～38℃、200r/min振荡培养至OD
600
为0.6
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0.8时，加入诱导剂IPTG至0.2mM，20℃诱导16
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18h，表达L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体酶。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用His Trap HP柱分离得到L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体。
[0021]本专利技术还提供所述L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体，或所述基因，或所述载体，或所述细胞，或所述基因工程菌在医药、食品和化工领域中的应用。
[0022]本专利技术还提供所述L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体，或所述基因，或所述载体，或所述细胞，或所述基因工程菌在制备含有L
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丙氨酸的产品中的应用。
[0023]有益效果：
[0024](1)本专利技术通过构建表达L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体的重组大肠杆菌，获得酶活提高的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体E88R，其纯酶比酶活达481
±
3.7U/mg，比野生型高2.1倍。
[0025](2)本专利技术提供的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体在pH 7.5条件下也具有高活力，突变体比酶活为199
±
2.1U/mg，比酶活比野生酶提高1.9倍。突变体E88R在温度45℃和50℃的残余酶活分别为85％、59％，在pH 7.0和pH 8.0条件下，残余酶活分别为88％和82％。相比野生型酶，该突变体酶E88R的热稳定性与pH稳定性都有很大的提高。
[0026](3)以2.5M马来酸作为底物，进行全细胞催化制备L
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丙氨酸，表达突变体酶E88R的重组菌株比表达野生型酶的重组菌株快4h完成反应，生产速率达35.66g/(L
·
h)，比野生型提高1.68倍。
附图说明
[0027]图1：野生酶和突变酶E88R在pH 7.5条件下的酶活柱状图，WT为野生酶。
[0028]图2：野生酶和突变酶E88R在4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.编码权利要求1所述L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的载体。4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述载体的细胞。5.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达权利要求1所述的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶突变体。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。7.一种提高L
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天冬氨酸β
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脱羧酶稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的L
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天冬氨酸β
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脱羧酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘中美，郝明珠，朱小青，崔睿智，周丽，崔文璟，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：