本发明专利技术公开了一种表达反式菊酸的联合表达载体及其构建方法和应用，所述联合表达载体是以植物表达载体为骨架，含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒和MCPI启动子驱动融合基因ADH2/ALDH1的表达盒，所述TcCDS基因为编码菊氨酰二磷酸合酶的基因，所述融合基因ADH2/ALDH1是由编码醇脱氢酶2的基因TcADH2和编码醛脱氢酶1的基因TcALDH1通过DNA连接子组成的融合基因，所述MCPI启动子为腺毛特异金属羧肽酶抑制剂类启动子。本发明专利技术在番茄VI型腺毛中重建了反式菊酸生物合成途径，产生大量的反式菊酸，结果表明，番茄VI型腺毛是通过代谢工程生物合成反式菊酸的一个高效平台。物合成反式菊酸的一个高效平台。物合成反式菊酸的一个高效平台。
【技术实现步骤摘要】
表达反式菊酸的联合表达载体及其在调控番茄VI型腺体腺毛合成反式菊酸中的应用
[0001]本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种合成反式菊酸的联合表达载体、构建方法及其在调控番茄VI型腺体腺毛合成反式菊酸中的应用。
技术介绍
[0002]天然除虫菊酯是一种源自菊科植物除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)的天然高效杀虫剂，具有广谱和强力的杀虫和驱虫作用，相较于化学合成的类似物，对哺乳动物毒性小，无环境危害，是生物农药的最优选择之一，具有广阔的应用前景。目前除虫菊酯的生产主要是从除虫菊植物中天然提取，然而除虫菊的种植深受海拔、土壤和气温的影响，全球每年的产量远远满足不了社会对天然除虫菊酯的需求。I型除虫菊酯是反式菊酸和三种来源于亚麻酸的rethrolone型醇形成的的酯。反式菊酸作为除虫菊酯的重要前体物质，一直以来只能被化学合成，但是这种方法成本高，来源受限并且大多对环境有害。
[0003]植物腺毛被称为代谢细胞工厂，有能力产生大量的特化代谢产物，如萜类化合物，并且已经被用作代谢工程的目标反应器，用于生产某些植物特化代谢产物。包括野生和栽培番茄在内的茄科植物腺毛的碳代谢已经进化到支持大量特化代谢产物的生产。例如，在某些茄属植物材料中，倍半萜羧酸的含量可达到叶片干重的12％以上。茄属植物栽培番茄的主要腺毛类型为顶部含有四个分泌细胞的三叶草状的第六型腺毛(VI型)，可产生大量的萜烯(大部分为单萜和少量倍半萜)。二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)是质体中甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径的两个最终产物之一，不仅是反式菊酸的前体物质，同时也是栽培番茄VI型腺毛质体中自然产生的单萜类化合物的前体物质。
技术实现思路
[0004]栽培番茄的VI型腺毛是植物的“库器官”。因此，使用腺毛特异性启动子将DMAPP的代谢通量从天然单萜转向反式菊酸生物合成不会对植物其他部分的正常生长和发育产生有害影响。相比之下，使用普遍型的启动子改变类异戊二烯前体IPP和DMAPP在叶片中的代谢流可能会对植物生长和发育产生严重影响，正如先前在烟草中观察到的那样(Gwak et al.,2017；Saxena et al.,2014)。此外，由于腺毛存在于植物的表面的位置，因此可以非常容易地通过简单的溶剂洗涤来收集腺毛中合成的特化代谢物，而不会提取到叶内部的代谢产物。
[0005]在新鉴定的VI型腺毛特异性启动子(金属羧肽酶抑制剂类启动子，MCPI promoter)驱动控制下，通过共表达反式菊酸生物合成途径相关基因，包括编码菊酰二磷酸合酶的TcCDS和编码醇脱氢酶2的TcADH2与编码醛脱氢酶1的TcALDH1组成的融合基因，本专利技术的专利技术人在番茄VI型腺毛中重建了反式菊酸生物合成途径。番茄VI型腺毛自然产生大量萜类化合物，这些萜类化合物与该酸具有共同的前体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。含有表达上述三种基因的VI型腺毛的整个番茄叶片的总反式菊酸的含量(以摩尔数计)约为非转
基因叶片中的主要单萜化合物β
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水芹烯含量的1.5倍。同时转基因叶片中β
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水芹烯和代表性倍半萜β
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石竹烯的含量分别降低了96％和81％。这些结果表明，番茄VI型腺毛是通过合成生物学手段来生物合成反式菊酸的一个高效平台，它有可能提高番茄植株内源防御能力和最终成为除虫菊酯异源大规模生物合成的生物反应器。
[0006]基于以上研究，本专利技术保护如下技术方案：
[0007]一种表达反式菊酸(trans
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Chrysanthemic acid)的联合表达载体，所述联合表达载体是以植物表达载体为骨架，含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒和MCPI启动子驱动融合基因ADH2/ALDH1的表达盒，所述TcCDS基因为编码菊氨酰二磷酸合酶的基因，所述融合基因ADH2/ALDH1是由编码醇脱氢酶2的基因TcADH2和编码醛脱氢酶1的基因TcALDH1通过DNA连接子组成的融合基因，所述MCPI启动子为腺毛特异金属羧肽酶抑制剂类启动子。
[0008]所述基因TcCDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因TcADH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因TcALDH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DNA连接子序列为5'GGCTCTGGTAGTAGTGGC 3'，所述MCPI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述植物表达载体为pPZP212，所述表达反式菊酸的联合表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0009]一种联合表达载体工程菌，由上述的表达反式菊酸的联合表达载体转入宿主制备而得。
[0010]所述联合表达载体工程菌为农杆菌。
[0011]上述的表达反式菊酸的联合表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0012]1)将MCPI启动子、Nos终止子和TcCDS基因片段组装到中间载体中，构建含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒的中间载体，从中间载体扩增出完整的表达盒导入植物表达载体中得到双元转化载体；
[0013]2)制备TcADH2和TcALDH1的融合基因ADH2/ALDH1，扩增融合基因ADH2/ALDH1、MCPI启动子和NOS终止子，构建到中间载体中，得到含有MCPI
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ADH2/ALDH1
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NOS序列的中间载体；
[0014]3)扩增步骤2)得到的中间载体中的MCPI
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ADH2/ALDH1
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NOS序列，导入步骤1)得到的双元转化载体中，得到表达反式菊酸的联合表达载体。
[0015]在上述技术方案中，步骤1)和步骤2)中所述的中间载体为pET28a(+)。
[0016]所述步骤1)中将MCPI启动子、Nos终止子和TcCDS基因片段组装到中间载体pET28a(+)的限制性内切酶NdeI和BamHI之间得到含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒的中间载体，从中间载体扩增出完整的表达盒导入植物表达载体pPZP212的EcoRI和SacI酶切位点之间中得到双元转化载体pPZP212
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CDS；
[0017]所述步骤2)中将融合基因ADH2/ALDH1、MCPI启动子和NOS终止子的扩增片段构建到中间载体pET28a(+)中；
[0018]所述步骤3)中将MCPI
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ADH2/ALDH1
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NOS序列的扩增片段导入pPZP212
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CDS载体的BamHI和SalI酶切位点之间，得到表达反式菊酸的联合表达载体pPZP212
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CAA。
[0019]所述步骤2)中融合基因ADH2/ALDH1通过使用HiFi DNA组装克隆试剂盒将TcADH2和TcALDH1的ORF序列的PCR扩增片段与它们之间的DNA连接子一起组装到pEAQ
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种表达反式菊酸(trans
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Chrysanthemic acid)的联合表达载体，其特征在于：所述联合表达载体是以植物表达载体为骨架，含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒和MCPI启动子驱动融合基因ADH2/ALDH1的表达盒，所述TcCDS基因为编码菊氨酰二磷酸合酶的基因，所述融合基因ADH2/ALDH1是由编码醇脱氢酶2的基因TcADH2和编码醛脱氢酶1的基因TcALDH1通过DNA连接子组成的融合基因，所述MCPI启动子为腺毛特异金属羧肽酶抑制剂类启动子。2.如权利要求1所述的表达反式菊酸的联合表达载体，其特征在于：所述基因TcCDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因TcADH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因TcALDH1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述DNA连接子序列为5'GGCTCTGGTAGTAGTGGC 3'，所述MCPI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述植物表达载体为pPZP212，所述表达反式菊酸的联合表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。3.一种联合表达载体工程菌，其特征在于：由权利要求1或2所述的表达反式菊酸的联合表达载体转入宿主制备而得。4.如权利要求3所述的联合表达载体工程菌，其特征在于：所述联合表达载体工程菌为农杆菌。5.如权利要求1或2所述的表达反式菊酸的联合表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将MCPI启动子、Nos终止子和TcCDS基因片段组装到中间载体中，构建含有MCPI启动子驱动TcCDS基因的表达盒的中间载体，从中间载体扩增出完整的表达盒导入植物表达载体中得到双元转化载体；2)制备TcADH2和TcALDH1的融合基因ADH2/ALDH1，扩增融合基因ADH2/ALDH1、MCPI启动子和NOS终止子，构建到中间载体中，得到含有MCPI
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ADH2/ALDH1
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NO...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐海洋，王莹，陈静，文静，王楚，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：
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