一种凝血酶响应的DNA纳米机器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种凝血酶响应的DNA纳米机器制备方法及应用，所述纳米机器包括DNA纳米结构、溶栓药物(tPA)复合物和凝血酶适配体链结构；通过排布好的DNA捕获链精确装载tPA分子药物，利用可控的DNA分子“锁扣”链，加入第三条凝血酶适配体链可使DNA纳米结构“上锁”，使得tPA药物包载在DNA纳米结构中。本发明专利技术公开的DNA纳米机器可以作为一种纳米尺度的分子机器用于tPA溶栓药物的装载，具有高凝血酶响应性，可有效响应血栓部位凝血酶环境，精准释放凝血酶，从而实现溶栓治疗有效运输到血栓部位，是一种精确载药、可控释放、具有较高溶栓效果的新型溶栓机器。新型溶栓机器。新型溶栓机器。

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶响应的DNA纳米机器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于纳米医学
，具体涉及一种凝血酶响应的DNA纳米机器及其制备方法和应用，尤其涉及一种凝血酶响应的DNA纳米机器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，临床中治疗缺血性中风和其他血栓形成相关疾病的标准疗法是在症状出现后3至4.5小时内静脉注射组织型纤溶酶原激活剂tPA。tPA可以催化血纤溶酶原转化为纤溶酶，在静脉注射tPA后会迅速分解纤维蛋白网络达到溶栓的目的。但是，目前tPA治疗在血栓患者中的使用仍存在高风险的出血并发症、较短的循环寿命和低靶向的缺点。因此，将tPA精确输送到血栓部位且按需释放tPA仍然是溶栓治疗的主要挑战。
[0003]目前用于凝血酶响应释放溶栓药的方案大多是将纳米载体与凝血酶裂解肽结合，一系列外源性或内源性刺激已被用于触发纳米载体中tPA的释放，包括磁场、超声波、剪切应力、H2O2和pH。然而，在动物模型中的溶栓效果仍然并不明显，这是由于纳米载体的结构异质性、负载溶栓药的剂量不明确以及刺激响应分子的不均匀分布，导致每个载体的生物分布、释放曲线和药代动力学的差异，从而影响了溶栓效果，使这种方案在使用中受到了限制。
[0004]DNA纳米结构凭借其结构可控，可寻址性及稳定性等特点，引起了研究者的广泛关注。相比于传统的溶栓药物载体，DNA纳米结构有着独一无二的优势。DNA纳米结构明确、尺寸均一、具有可寻址性，精确控制装载药物的数量和位置，这是纳米颗粒所不能实现的；易修饰，内部进行功能化修饰，能够有效装载具有活性的多种药物，包括蛋白、小分子药物、适配体等；更重要的是，DNA结构形貌可控，通过设计，结合响应分子或靶向功能基团，可以实现有效靶向病灶部位，同时，在特定条件下可控开启和关闭，达到控制药物释放的目的。此外，生理条件下的结构稳定性和DNA纳米结构优异的生物相容性特别适合作为体内药物递送载体。以上DNA纳米结构的卓越性质为开发体内精准溶栓药物带来了新的契机，用于体内溶栓治疗的DNA纳米结构的精确给药方案现有技术中尚未有记载。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有溶栓药物治疗中的缺陷，提供一种凝血酶响应的DNA纳米机器及其制备方法与应用。所述DNA纳米机器通过精确的位点设计将溶栓药物分子tPA杂交到DNA纳米结构的内部，形成管状三维结构，并在管状DNA纳米结构的两端设置可控DNA杂交三链开关，以响应血栓部位高浓度的凝血酶，实现了溶栓药物的靶向输送和可控释放，专利技术得到一种精确载药、可控释放、具有较高溶栓效果的新型溶栓纳米机器。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种凝血酶响应的DNA纳米机器，所述DNA纳米机器包括DNA纳米结构、tPA
‑
ssDNA复合物和凝血酶适配体链；所述DNA纳米结构由DNA模板链、DNA订书钉链和功能DNA链组装形成，所述功能DNA链包括DNA捕获链和DNA“锁扣”链；通过将DNA模
板链、DNA订书钉链和DNA功能链混合，组装而成DNA折纸结构；
[0008]本专利技术中，所述DNA模板链优选为M13mp18噬菌体基因组DNA；利用M13mp18噬菌体的环状DNA单链作为主链，过量的DNA订书钉链作为辅链，通过主链与可编程的辅链在特定位置杂交互补，组装形成一种二维矩形平板DNA纳米结构即DNA折纸平板，所述M13mp18噬菌体基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0009]本专利技术中，所述DNA订书钉链根据文献1“Tuning the structural asymmetries of three
‑
dimensional gold nanorod assemblies”进行设计，文献1的DOI：10.1039/c5cc05295e；
[0010]本专利技术中，所述DNA捕获链由在辅助折叠DNA链的5
’
端加上与tPA
‑
ssDNA复合物的DNA序列互补杂交的捕获序列形成，能够精准控制tPA
‑
ssDNA在矩形平板DNA纳米结构表面的数量和相对位置；DNA捕获链的设计可以根据需要进行增多、减少或位点的变更，在整个DNA纳米结构的平面上均可以进行设计；优选地，设计有24条DNA捕获链锚定在DNA纳米结构表面；进一步优选地，每3条DNA捕获链捕获一个tPA
‑
ssDNA分子，即所述tPA
‑
ssDNA复合物的个数为8个，优选的，所述24条DNA捕获链核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3
‑
26所示。
[0011]本专利技术中，所述tPA
‑
ssDNA复合物通过与DNA纳米结构上的捕获链杂交从而装载在纳米机器内部，tPA
‑
ssDNA复合物制备过程包括：采用tPA与磺基琥珀酰亚胺4
‑
[N
‑
甲基马来酸]‑1‑
羧环己烷(SMCC)按照1：20浓度比例在4℃条件下反应4小时，所得样品用30KD超滤管纯化除去多余SMCC，tPA
‑
SMCC通过点击化学反应与ssDNA链即巯基DNA，连接形成tPA
‑
ssDNA复合物；优选地浓度比例为1：20，反应条件为4℃反应至少8小时，所得样品用30KD超滤管纯化除去多余ssDNA，所述ssDNA序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本专利技术中，所述DNA“锁扣”链为与凝血酶适配体链互补的两条DNA链，组装在矩形平板DNA纳米结构的两条长边上，与所述凝血酶适配体链杂交后，矩形平板DNA纳米结构的尺寸优选为长90nm、宽60nm；将二维矩形平板DNA纳米结构卷曲闭合形成三维管状DNA纳米机器，最终制备得到内部装载有tPA的，同时具有可控响应凝血酶的管状DNA纳米机器；所述管状DNA纳米机器为管状三维结构，优选的，根据矩形平板DNA纳米结构的优选尺寸卷曲后的管状DNA纳米机器，其尺寸为底部直径19nm，长90nm。
[0013]本专利技术中，所述凝血酶响应链为一段可以特异性识别凝血酶的DNA序列，凝血酶响应链在现有技术中已经用于检测凝血酶，结合其他纳米结构实现了凝血酶的定性和定量检测，例如文献2“刘冰，基于纳米金核酸适配体的光谱分析及在蛋白检测中的应用，湘潭大学硕士学位论文(中国有限硕士学位论文全文数据库)，2014”的“第三章核酸适配体修饰纳米金的荧光分析法检测凝血酶”中记载了利用纳米金与凝血酶的核酸适配体结合制成探针，结合纳米金对荧光素的荧光猝灭作用，对凝血酶进行定性定量的检测。本专利技术中，将文献2中的核酸适配体作为本专利技术的凝血酶响应链，目的并不仅仅是为了识别凝血酶，而是为了打开本专利技术所述DNA纳米机器，以暴露其中的tPA分子药物，从而实现高效溶栓。优选的，所述凝血酶响应链序列如SEQ ID NO:27所示。
[0014]优选地，设计6对DNA“锁扣”链组装至本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶响应的DNA纳米机器，其特征在于，所述凝血酶响应的DNA纳米机器包括DNA纳米结构、tPA
‑
ssDNA复合物和凝血酶适配体链；所述DNA纳米结构包含DNA模板链、DNA订书钉链和DNA功能链；所述DNA订书钉链用于辅助折叠DNA模板链完成组装；所述DNA功能链包括DNA捕获链和DNA“锁扣”链；所述DNA捕获链由在DNA订书钉链的5
’
端加上与tPA
‑
ssDNA复合物的DNA序列互补杂交的捕获序列形成，用于捕获tPA
‑
ssDNA复合分子；所述DNA“锁扣”链由DNA纳米结构两端的DNA订书钉链的5
’
或3
’
端加上与凝血酶适配体链序列部分或完全互补杂交的序列形成；所述DNA“锁扣”与凝血酶适配体链杂交形成三链杂交结构；所述凝血酶适配体链为一段可以特异性识别凝血酶的DNA序列。2.根据权利要求1所述的DNA纳米机器，其特征在于，所述DNA模板链为M13mp18噬菌体基因组DNA，所述M13mp18噬菌体基因组DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的DNA纳米机器，其特征在于，每个DNA纳米结构锚定24条DNA捕获链，每3条DNA捕获链捕获一个tPA
‑
ssDNA复合分子。4.根据权利要求3所述的DNA纳米机器，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：晁洁，高宇，汪联辉，印珏，王思雨，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：