检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术涉及基因技术领域，具体而言，涉及一种检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法。本发明专利技术使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性，检测时耗短、成本低，结果直观好判读。结果直观好判读。结果直观好判读。

【技术实现步骤摘要】
检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法


[0001]本专利技术涉及基因
，具体而言，涉及一种检测线粒体3243A＞G突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法。

技术介绍

[0002]线粒体是真核细胞中重要的细胞器，是为细胞提供能量的场所，其氧化代谢为机体提供了80%以上的能量。线粒体 DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）是细胞核染色体外的基因组，具有自我复制、转录和编码功能，是一套相对独立的遗传控制系统，但同时又受到核DNA 的控制。人类的mtDNA分子是一个长 16569bp 的双链闭环超螺旋 DNA分子，包括一条轻链（L链）和一条重链（H链），IL、IH1和IH2分别是L链和H链的转录起始点，包含有 13 个多肽编码基因，22个tRNA基因和 2个rRNA 基因。这些基因呈紧密排列，任何随机性突变都将诱导编码 DNA 序列过程，造成线粒体功能的异常。
[0003]线粒体病是指由于mtDNA或核 DNA缺陷引起线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍为特点的一组遗传性疾病，不包括其他因素导致的继发性线粒体功能障碍性疾病。目前已发现近 200 种不同的人类 mtDNA 突变。A3243G 突变是mtDNA 上最常见的致病突变。m.3243A>G 突变位于 tRNALeu(UUR)基因的双氢尿嘧啶环中，此处是 16S rRNA 和t RNALeu(UUR)基因之间的交界处，是促进转录终止的蛋白质因子结合部位。因而，该位点发生基因突变将导致转录终止因子结合障碍，线粒体氧化磷酸化蛋白合成缺陷，ATP 生成不足。
[0004]m.3243A>G 突变患者可表现为综合征或非综合征线粒体疾病，也可以是无症状患者。m.3243A>G 突变最常见的综合征表现是线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征（mitochondria encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke
‑
like episodes，MELAS），随后研究发现更多与 m.3243A>G 突变相关的临床表型，包括母系遗传糖尿病伴耳聋（(maternallyinheriteddiabetesanddeafness, MIDD）、以肢带型无力为主要症状的线粒体肌病，以及肠梗阻、胰腺炎等非典型 MELAS综合征。
[0005]单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入等，常用的分析方法有PCR
‑
测序法、Sanger测序法、高通量测序技术、PCR
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芯片杂交法、突变扩增系统(amplification refractory mutation system, ARMS)等。这些传统技术中，直接测序的方法时间周期较长，不能及时为医生提供指导；芯片法成本高，使应用受到一定限制。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一方面涉及一种引物对探针组合产品，所述引物对包括：选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：3至少一种所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；
所述探针包括SEQ ID NO：5所示的检测探针。
[0008]本专利技术的第二方面涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
[0009]本专利技术的第三方面检测线粒体基因 3243A＞G 突变的方法，其包括：使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增，并根据所述检测探针所述发出信号判断所检测位点的突变情况。
[0010]或者包括：使用如上所述的引物探针组合产品对待检测核酸进行扩增，获取所述检测探针和所述内参探针的Ct值，分别定义为Ct
检测
和Ct
内参
，并计算ΔCt=|Ct
检测
‑
Ct
内参
|；若ΔCt ≤14.8，则代表所述待检测核酸发生3243A＞G 突变。
[0011]本专利技术的第四方面还涉及如上所述的引物探针组合产品在制备线粒体病检测试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术使用ARMS结合荧光PCR技术具有高特异性以及高灵敏性，检测时耗短、成本低，结果直观好判读。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0014]图1为本专利技术一个实施例中ROC曲线图。
具体实施方式
[0015]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0016]除非另有说明，用于披露本专利技术的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本专利技术所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本专利技术的教导。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0017]本专利技术中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
[0018]本专利技术中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
[0019]本专利技术涉及一种引物对和探针组合产品，所述引物对包括：选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：3至少一种所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；所述探针包括SEQ ID NO：5所示的检测探针。
[0020]在一些实施方式中，所述引物对还包括内参引物对，所述探针还包括内参探针。
[0021]在一些实施方式中，所述内参引物对和所述内参探针用于定量检测线粒体保存区域的核酸片段的表达。
[0022]在一些实施方式中，所述内参引物对的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0023]另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1~8所示的引物或探针具有大于60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列。还考虑了这样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物对探针组合产品，其特征在于，所述引物对包括：选自核苷酸序列如SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：3至少一种所示的上游引物，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；所述探针包括SEQ ID NO：5所示的检测探针。2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述引物对还包括内参引物对，所述探针还包括内参探针。3.根据权利要求2所述的组合产品，其特征在于，所述内参引物对和所述内参探针用于定量检测线粒体保守区域的核酸片段的表达。4.根据权利要求3所述的组合产品，其特征在于，所述内参引物对的上游引物、下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。5.根据权利要求2~4任一项所述的组合产品，其特征在于，所述探针为自身淬灭探针，且所述内参探针与所述检测探针的荧光发射基团信号可区分。6.含有权利要求1~5任一项所述的组合产品的试剂盒。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg
2+
、UNG 酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，
申请(专利权)人：广州嘉检医学检测有限公司，
类型：发明
国别省市：