一种NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法技术

本发明专利技术公开了一种NGS核心酶Klenow片段的制备方法及其应用。本发明专利技术提供的NGS核心酶Klenow片段的制备方法包括如下步骤：1）将Klenow片段表达载体转化宿主菌，得到重组菌；2）在所述重组菌的培养体系中添加0.5 mM的IPTG进行诱导培养，得到诱导后菌体；3）从所述诱导后菌体中纯化得到所述Klenow片段，所述纯化的方法依次包括如下步骤：PEI沉淀核酸、饱和硫酸铵沉淀目的蛋白、Ni

【技术实现步骤摘要】
一种NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法。

技术介绍

[0002]Klenow片段是E.coli DNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段，大小为68KD。该片段保留了DNA聚合酶I的5'
‑
3'。聚合酶和3'
‑
5'外切酶活性，但缺少完整酶的5'
‑
3'外切酶活性。Klenow片段的3'
‑
5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性。Klenow片段的主要作用如下：双链DNA 5'突出（5'overhang）末端的补平（fill
‑
in）；双链DNA 3'突出（3'overhang）末端的打平（也称削平）；5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。
[0003]NGS是二代测序技术，又称高通量测序，以高输出量和高解析度为主要特色，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列读取，在提供丰富的遗传学信息的同时，还可以大大降低测序费用，缩短测序时间。实验过程包括样本准备，文库构建，测序反应和数据分析四个环节。在二代测序应用中，Klenow片段主要用于文库构建过程中双链DNA片段的平末端处理，以便于后续的测序反应。由于此酶在NGS中被广泛应用；并且目前国内生产的Klenow片段纯度和活性均有限，因此制备出高纯度、高活性的Klenow片段势在必得。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种高纯度NGS核心酶Klenow片段的诱导纯化及质控方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术首先提供了一种Klenow片段的制备方法。
[0006]本专利技术提供的Klenow片段的制备方法包括如下步骤：A1）将Klenow片段表达载体转化宿主菌，得到重组菌；所述Klenow片段表达载体为将Klenow片段的编码基因序列连入pET
‑
28a载体后得到的载体；A2）在所述重组菌的培养体系中添加0.5 mM的IPTG进行诱导培养，得到诱导后菌体；A3）从所述诱导后菌体中纯化得到所述Klenow片段；所述纯化的方法依次包括如下步骤：PEI沉淀核酸、饱和硫酸铵沉淀目的蛋白、Ni离子亲和柱富集目的蛋白、强阴离子柱去除杂蛋白和残余核酸、丁基疏水柱去除杂蛋白。
[0007]上述方法中，所述步骤A1）中，所述Klenow片段的编码基因序列具体如序列表中序列1所示。所述宿主菌具体可为大肠杆菌BL
‑
21。
[0008]上述方法中，所述步骤A2）中，培养所述重组菌的方法具体包括如下步骤：将单个重组菌落接种于TB液体培养基中，在37℃、220 rpm条件下过夜培养；次日取出过夜培养的菌液接种于TB液体培养基中，在37℃、220 rpm条件下进行扩大培养。
[0009]培养所述重组菌至OD
600nm
为0.6
‑
0.8时，向培养体系中添加0.5 mM的IPTG进行诱导
培养。
[0010]所述诱导培养条件具体可为30℃、220 rpm诱导培养10 h。
[0011]所述诱导培养后还包括如下步骤：将诱导培养后的菌液在4℃、12000 rpm条件下离心25 min，弃上清液，收集菌体，即为所述诱导后菌体。
[0012]上述方法中，所述步骤A3）中，利用所述强阴离子柱进行纯化的步骤进行两次；利用所述丁基疏水柱进行纯化的步骤进行两次。
[0013]进一步的，所述纯化的方法可包括如下步骤：B1）向所述诱导后菌体中加入裂解液，超声破碎，得到超声破碎后菌体；将所述超声破碎后菌体离心，收集初始上清液；B2）完成步骤B1）后，向所述初始上清液中加入PEI溶液，孵育，离心，收集上清液；B3）完成步骤B2）后，向所述上清液中加入饱和硫酸铵，孵育，离心，收集沉淀，并向所述沉淀中加入Ni离子柱平衡液，得到处理后样本；B4）完成步骤B3）后，利用Ni离子亲和柱将所述处理后样本进行纯化，得到Ni离子柱纯化后溶液；B5）完成步骤B4）后，利用强阴离子柱将所述Ni离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第一次强阴离子柱纯化后溶液；B6）完成步骤B5）后，再次利用强阴离子柱将所述第一次强阴离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第二次强阴离子柱纯化后溶液；B7）完成步骤B6）后，利用丁基疏水柱将所述第二次强阴离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第一次丁基柱纯化后溶液；B8）完成步骤B7）后，利用丁基疏水柱将所述第一次丁基柱纯化后溶液进行纯化，得到第二次丁基柱纯化后溶液；B9）完成步骤B8）后，将所述第二次丁基柱纯化后溶液在蛋白透析液中进行透析，得到纯化后的Klenow片段。
[0014]更进一步的，所述步骤B1）中，所述诱导后菌体与所述裂解液的配比具体可为15 g：150 mL。
[0015]所述裂解液为裂解液Buffer A。所述裂解液Buffer A由浓度为50 mM、pH为8.0的Tris
‑
HCl溶液、EDTA、Tween
‑
20和NaCl组成，其中，EDTA在所述裂解液Buffer A中的浓度为1 mM，Tween
‑
20在所述裂解液Buffer A中的浓度为0.5%（体积分数），NaCl在所述裂解液Buffer A中的浓度为800 mM。
[0016]所述超声破碎的条件具体可为超5 s，停5 s，功率为40 W，共超声30 min。
[0017]所述离心的条件具体可为4℃、10000 rpm离心20 min。
[0018]所述步骤B2）中，在所述初始上清液中按照体积分数为0.7%的比例加入所述PEI溶液。所述PEI溶液具体可为10% PEI溶液。所述10% PEI溶液的配制方法具体如下：将50% PEI母液用超纯水稀释至10%，得到10% PEI溶液。
[0019]所述孵育的条件具体可为4℃孵育搅拌0.5 h。
[0020]所述离心的条件具体可为4℃、10000 rpm离心20 min。
[0021]所述步骤B3）中，向所述上清液中加入饱和硫酸铵（100%），使溶液中硫酸铵的终浓度为60%。所述饱和硫酸铵（100%）配制方法具体如下：先在1L超纯水中加入800g硫酸铵（在
25℃条件下），然后用微波炉加热到溶解为止，再过夜放置，得到有晶体析出的饱和硫酸铵（100%）溶液。
[0022]所述孵育的条件具体可为4℃孵育搅拌0.5 h。
[0023]所述离心的条件具体可为4℃、10000 rpm离心20 min。
[0024]在所述沉淀中加入与所述初始上清液等体积的Ni离子柱平衡液。
[0025]所述步骤B4）中，利用Ni离子亲和柱进行纯化过程中包括用Ni离子柱平衡液进行平衡、用Ni离子柱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Klenow片段的制备方法，包括如下步骤：A1）将Klenow片段表达载体转化宿主菌，得到重组菌；所述Klenow片段表达载体为将Klenow片段的编码基因序列连入pET
‑
28a载体后得到的载体；A2）在所述重组菌的培养体系中添加0.5 mM的IPTG进行诱导培养，得到诱导后菌体；A3）从所述诱导后菌体中纯化得到所述Klenow片段；所述纯化的方法依次包括如下步骤：PEI沉淀核酸、饱和硫酸铵沉淀目的蛋白、Ni离子亲和柱富集目的蛋白、强阴离子柱去除杂蛋白和残余核酸、丁基疏水柱去除杂蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A1）中，所述Klenow片段的编码基因序列如序列表中序列1所示；所述步骤A1）中，所述宿主菌为大肠杆菌BL
‑
21。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A2）中，培养所述重组菌至OD
600nm
为0.6
‑
0.8时，向培养体系中添加0.5 mM的IPTG进行诱导培养；所述步骤A2）中，所述诱导表达的条件为30℃、220 rpm诱导培养10 h。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤A3）中，所述纯化的方法包括如下步骤：B1）向所述诱导后菌体中加入裂解液，超声破碎，得到超声破碎后菌体；将所述超声破碎后菌体离心，收集初始上清液；B2）完成步骤B1）后，向所述初始上清液中加入PEI溶液，孵育，离心，收集上清液；B3）完成步骤B2）后，向所述上清液中加入饱和硫酸铵，孵育，离心，收集沉淀，并向所述沉淀中加入Ni离子柱平衡液，得到处理后样本；B4）完成步骤B3）后，利用Ni离子亲和柱将所述处理后样本进行纯化，得到Ni离子柱纯化后溶液；B5）完成步骤B4）后，利用强阴离子柱将所述Ni离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第一次强阴离子柱纯化后溶液；B6）完成步骤B5）后，再次利用强阴离子柱将所述第一次强阴离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第二次强阴离子柱纯化后溶液；B7）完成步骤B6）后，利用丁基疏水柱将所述第二次强阴离子柱纯化后溶液进行纯化，得到第一次丁基柱纯化后溶液；B8）完成步骤B7）后，利用丁基疏水柱将所述第一次丁基柱纯化后溶液进行纯化，得到第二次丁基柱纯化后溶液；B9）完成步骤B8）后，将所述第二次丁基柱纯化后溶液在蛋白透析液中进行透析，得到纯化后的Klenow片段。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤B1）中，所述裂解液为裂解液Buffer A；所述裂解液Buffer A由浓度为50 mM、pH为8.0的Tris
‑
HCl溶液、EDTA、Tween
‑
20和NaCl组成，其中，EDTA在所述裂解液Buffer A中的浓度为1 mM，Tween
‑
20在所述裂解液Buffer A中的浓度为0.5%，NaCl在所述裂解液Buffer A中的浓度为800 mM。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤B4）中，利用Ni离子亲和柱进行纯化过程中包括用Ni离子柱平衡液进行平衡、用Ni离子柱高盐溶液进行核酸洗脱和Ni离子柱洗脱液进行洗脱的步骤；
所述Ni离子柱平衡液由浓度为20 mM、pH为7.4的PB溶液、NaCl和甘油组成，其中，NaCl在所述Ni离子柱平衡液中的浓度为0.1 M，甘油在所述Ni离子柱平衡液中的浓度为5%；所述Ni离子柱高盐溶液由浓度为20 mM、pH为7.4的PB溶液、NaCl和甘油组成，其中，NaCl在所述Ni离子柱高盐溶液中的浓度为2 M，甘油在所述Ni离子柱高盐溶液中的浓度为5%；所述Ni离子柱洗脱液由浓度为20 mM、pH为7.4的PB溶液、NaCl、甘油和咪唑组成，其中，NaCl在所述Ni离子柱洗脱液中的浓度为0.1 M，甘油在所述Ni离子柱洗脱液中的浓度为5%，咪唑在所述Ni离子柱洗脱液中的浓度为500 mM；所述步骤B5）和步骤B6）中，利用强阴离子柱进行纯化过程中包括用Q柱平衡液进行平衡和Q柱洗脱液进行洗脱的步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡佳佳，韩典霖，
申请(专利权)人：济凡生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：