一种RPA-CRISPR/Cas12a-FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用技术方案

本发明专利技术属于水体微生物检测技术领域，具体公开了一种RPA

【技术实现步骤摘要】
一种RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及环境水体微生物检测
，特别是涉及一种RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用。

技术介绍

[0002]水体环境是病原微生物传播的重要传播途径之一，水体环境中病原微生物所导致的传染病在包括非洲、中南美洲以及南亚等全球欠发达地区依然频繁的发生，这严重威胁到水体环境所处人群的生命和健康安全。由于水体环境中病原微生物具有丰度低、种类多和风险异质性高等特点，研究和发展各种病原微生物的检测技术及方法，对准确、快捷地确认病原体及有效控制病原微生物的传播具有重要意义。
[0003]目前，水体环境中常见的病原微生物主要包括金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、结核杆菌等，其可以通过呼吸道、消化道以及皮肤进入人体并引起肺炎、伤寒、痢疾和霍乱等多种疾病。这些病原微生物一般不是水体原有微生物，大部分来自外源污染。携带大量病原微生物的污水直接排放或未彻底处理进入受纳水体，并扩展至水源水体，进而进入饮用水处理与管网系统。
[0004]当前，对环境水体中病原微生物的检测主要依靠传统的细菌培养和生化鉴定法，然而其检测周期长、检测技能要求高以及检测品种单一等缺点成为阻碍环境病原微生物检测发展的主要因素。另外，近些年发展的以抗原抗体的免疫结合与识别为基础发展起来的鉴定技术也逐步应用于病原微生物的检测中，虽然这种检测技术能够较为迅速的检测病原微生物，然而由于其鉴定单一、敏感度低，一直未能进一步发展与推广，只能作为初步鉴定。分子生物学及分子遗传学的发展，使微生物的检测也从生化、免疫方法转向基因水平的检测，基于DNA序列的特异引物PCR及其相关技术是当今快速、准确鉴定菌种的方法之一，可避免培养方法和生化鉴定方法的繁琐，在临床及环境样本的检测中广为应用。然而，这类检测技术依然具有检测时间较长、易出假阳性和定量困难等缺点。
[0005]因此，水环境病原微生物的快速准确检测方法亟须建立，其在水质监测和微生物风险评估中发挥着重要作用，是水安全目标实现的重要基础。

技术实现思路

[0006]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统及其在环境水体生物检测中的应用，通过结合RPA等温扩增技术，采用CRISPR/Cas12a的反式切割特点对环境中的微生物进行荧光快速高通量检测，从而解决传统环境水体中病原体微生物检测方法耗时长、操作复杂、反应不灵敏等问题。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术第一方面提供一种RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系，用于检测环境水体中的目标生物，所述RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系包括Cas12a蛋白、单链DNA(ssDNA)荧光探针、crRNA、扩增后的目标生物的目标DNA片段，所述目
标DNA片段通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA而获得。
[0008]进一步，所述RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系包括：2μL 10
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NEBuffer2.1反应缓冲液，1μL 1pM的Cas12a蛋白，2μL 2pM单链DNA(ssDNA)荧光探针，1μL 1pM的crRNA，和2μL扩增后的目标生物的目标DNA片段，共20μL。
[0009]进一步，所述Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中的任意一种，优选为LbCas12a蛋白。
[0010]进一步，所述单链DNA荧光探针的序列为TTATT。
[0011]进一步，所述单链DNA荧光探针5
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端和3
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端分别带有一个荧光基团(fluorophore)和一个荧光猝灭基团(quencher)，所述荧光基团包括不限于HEX、FAM和TAMRA等，所述猝灭基团包括但不限于IOWA和BHQ1。
[0012]进一步，所述单链DNA荧光探针的序列如SEQ ID NO.12所示。
[0013]进一步，所述crRNA选自crRNA1、crRNA2、crRNA3中的至少一种，所述crRNA1、crRNA2、crRNA3的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0014]进一步，RPA等温扩增反应过程包括：将Primer Free Rehydration buffer、Primer mix、目的基因组DNA和ddH2O混匀配制成RPA等温扩增体系，向RPA等温扩增体系中添加MgOAc并迅速混匀，放置于PCR仪中37℃孵育扩增20min，立刻85℃高温停止反应，获得的混合物即为扩增后的目的DNA片段。
[0015]进一步，所述RPA等温扩增体系包括：Primer Free Rehydration buffer 15μL，Primer mix 1.2μL，目的基因组DNA 1μL，浓度为280mM的Magnesium Acetate(MgOAc)1.2μL和ddH2O 6.6μL，共25μL。
[0016]进一步，所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
[0017]进一步，所述目的基因组DNA为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0018]进一步，所述nuc基因扩增序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
[0019]进一步，所述RPA扩增引物为nuc基因扩增引物，所述nuc基因扩增引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0020]本专利技术第二方面提供一种运用RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统检测环境水体目标生物的方法，包括如下步骤：
[0021]A、从待检测环境水体样本获得目标生物混合物，并从获得的目标生物混合物中获得目的基因组DNA；
[0022]B、以目标生物的目的基因组DNA为打靶位点，按照重组酶聚合酶扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplification)的设计原则设计RPA扩增引物，并通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA，获得待检测高拷贝目的DNA片段；
[0023]C、按照crRNA的设计原则设计并合成目的基因的crRNA序列，设计并合成ssDNA荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系，其特征在于，用于检测环境水体中的目标生物，所述RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系包括Cas12a蛋白、单链DNA荧光探针、crRNA、扩增后的目标生物的目标DNA片段，所述目标DNA片段通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA而获得。2.根据权利要求1所述的RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系，其特征在于：所述Cas12a蛋白选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中的任意一种；所述单链DNA荧光探针的序列为TTATT，所述单链DNA荧光探针5
’
端和3
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端分别带有一个荧光基团和一个荧光猝灭基团，所述荧光基团选自HEX、FAM、TAMRA中的任意一种，所述猝灭基团为IOWA或BHQ1；所述crRNA选自crRNA1、crRNA2、crRNA3中的至少一种，所述crRNA1、crRNA2、crRNA3的序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ检测体系，其特征在于：所述目标生物为微生物，所述微生物为金黄色葡萄球菌，所述目的基因组DNA为金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc，nuc基因的序列如SEQ ID NO.1所示，nuc基因扩增序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，RPA扩增引物为nuc基因扩增引物，nuc基因扩增引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。4.一种运用RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统检测环境水体目标生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：A、从待检测环境水体样本获得目标生物混合物，并从获得的目标生物混合物中获得目的基因组DNA；B、以目标生物的目的基因组DNA为打靶位点，按照重组酶聚合酶扩增技术RPA的设计原则设计RPA扩增引物，并通过RPA等温扩增技术扩增目的基因组DNA，获得待检测高拷贝目的DNA片段；C、按照crRNA的设计原则设计并合成目的基因的crRNA序列，设计并合成ssDNA荧光探针；D、将步骤B中的目的DNA片段、步骤C中的crRNA和单链DNA荧光探针与Cas12a蛋白一起共同孵育，共同孵育后所得的混合物即为RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统，将RPA
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CRISPR/Cas12a
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FQ系统在荧光检测系统下观察拍照，获得检测结果。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目标生物包括微生物、浮游生物以及可以用环境DNA进行检测的各类生物；...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴得胜，刘立，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：