一种乳酸菌多铜氧化酶的制备及其在降解生物胺中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种乳酸菌多铜氧化酶的制备及其在降解生物胺中的应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术所提供的多铜氧化酶来源于清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，将其在大肠杆菌中异源表达生产得到。该酶具有较好的降解生物胺的性能，在低浓度下即可降解40.90％的组胺及41.24％的酪胺。在高盐条件下，其降胺性能均可以进一步提升，对组胺和酪胺的降解率分别为75.95％和66.81％。并且在高乙醇条件下也能保持部分降胺能力。将其应用于腌鱼、葡萄酒等发酵食品模拟体系中均有较好的降胺效果，可广泛应用于工业化生产。泛应用于工业化生产。泛应用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸菌多铜氧化酶的制备及其在降解生物胺中的应用


[0001]本专利技术涉及一种乳酸菌多铜氧化酶的制备及其在降解生物胺中的应用，尤其涉及一种来源于清酒乳杆菌的多铜氧化酶Ls1b的基因、制备方法与其在降解生物胺中的应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]生物胺是一类具有生物活性的小分子含氮有机化合物，它们广泛存在于食品，尤其是蛋白质含量较高的发酵食品中。主要由相应的氨基酸通过微生物的脱羧作用形成，或由醛、酮类物质在氨基酸转氨酶作用下产生。适量的生物胺可以促进人体正常的生理活动，但摄入过量外源生物胺则会引起人体诸多不良反应，严重时可能危及生命。其中酪胺和组胺对人体的潜在危害最大。
[0003]对于食品中的生物胺，化学法、酶法、微生物法被认为是降低发酵食品生物胺积累的有效方式。中国计量大学2019年申请了“一种采用杨梅叶提取物控制酱油中生物胺含量的方法”(申请号：201910058795.4)，中国海洋大学2020年申请了“库德毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)在降解生物胺方面的应用”(申请号：202010332776.9)。以上方法具有各自不可避免的局限性，如降解生物胺种类少、降解效果差、营养成分的流失、风味的改变及安全性存疑等。与上述控制技术不同的是，通过向发酵食品中添加生物胺降解酶，不造成食品营养物质损失，不产生新的毒性物质，可以有效控制食品中的生物胺积累。
[0004]蓝色多铜氧化酶家族可催化氧化多种底物，其中部分酶可以催化氧化生物胺生成对应的醛、氨和水。此类酶广泛存在于植物、真菌和细菌中，细菌多铜氧化酶的部分特征如不需要糖基化、耐盐、稳定性好等，相较于真菌酶在某些应用上更具优势。江南大学2018年申请了“新型多铜氧化酶及其在降解生物胺中的应用”(申请号：201811383747.4)，其中公开了利用来源于Weissellacibaria的多铜氧化酶。但目前针对能降解生物胺的细菌多铜氧化酶的研究还是较少，因此筛选能降解生物胺，尤其是降解毒性较大的组胺和酪胺能力强的多铜氧化酶是具有非常广阔应用前景的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种来源于清酒乳杆菌的重组多铜氧化酶Ls1b，并且将其应用于食品生物胺的降解。
[0006]本专利技术提供了一种降解食品中生物胺的方法，所述方法是利用来源于清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)的多铜氧化酶降解生物胺，所述多铜氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]在一种实施方式中，将所述多铜氧化酶添加至含有组胺、酪胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺的体系中，所述生物胺的含量为50～200mg/L。
[0008]优选的，所述酪胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺的含量为50～100mg/L。
[0009]更优选的，所述组胺和酪胺的含量为50～100mg/L，并且所述腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺的含量为50mg/L。
[0010]在一种实施方式中，所述多铜氧化酶按照体系中每毫克生物胺添加不少于0.14U的量添加。
[0011]优选的，所述多铜氧化酶按照体系中每毫克生物胺添加0.14～1.32U的量添加。
[0012]更优选的，所述多铜氧化酶按照体系中每毫克生物胺添加0.33U、1.32U、0.25U、0.14U的量添加。
[0013]在一种实施方式中，反应体系中的乙醇含量为0～20％、氯化钠浓度为0～10％。
[0014]在一种实施方式中，在pH4.0～7.0、15～30℃下反应。
[0015]在一种实施方式中，反应时间不少于20h。
[0016]优选的，反应时间为20～24h。
[0017]在一种实施方式中，所述食品包括但不限于腌鱼、葡萄酒、酱油、豆瓣酱。
[0018]本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多铜氧化酶在降解生物胺中的应用。
[0019]在一种实施方式中，所述生物胺包括组胺、酪胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺。
[0020]在一种实施方式中，降解生物胺的反应体系中的生物胺含量为50～200mg/L。
[0021]本专利技术提供了含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的表达载体、表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多铜氧化酶的微生物细胞、或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多铜氧化酶在制备降解生物胺的产品中的应用。
[0022]在一种实施方式中，所述产品包括生物酶复合剂。
[0023]在一种实施方式中，所述微生物细胞可以为大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌。
[0024]在一种实施方式中，所述微生物细胞以包括pET系列、pUC系列、pWB系列载体为表达载体。
[0025]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的重组多铜氧化酶降解生物胺的效果较好，在低浓度下即可降解40.90％的组胺及41.24％的酪胺。在高浓度乙醇条件下仍能保持20％以上的组胺、酪胺降解率。在高盐条件下降解生物胺的能力可进一步提升，在本专利技术的条件下组胺降解率最多可达75.95％，酪胺最多可达66.81％，在高盐度的条件下对于酪胺和组胺的降解率显著优于现有报道的多铜氧化酶，在高盐食品中有较大应用潜力。并且，将本专利技术的多铜氧化酶应用在不同食品基质的模拟体系中均有较好的降胺效果，可应用的范围广泛。
附图说明
[0026]图1是L.sakei中多铜氧化酶基因的验证图；其中，M泳道为Marker；1
‑
3泳道为L.sakei中多铜氧化酶基因；4泳道为阴性对照；
[0027]图2是重组多铜氧化酶添加量对组胺降解率的影响；
[0028]图3是盐度及pH对重组多铜氧化酶对组胺降解率的影响；
[0029]图4是乙醇含量对重组多铜氧化酶对组胺降解率的影响；
[0030]图5是重组多铜氧化酶添加量对酪胺降解率的影响；
[0031]图6是盐度及pH对重组多铜氧化酶对酪胺降解率的影响；
[0032]图7是乙醇含量对重组多铜氧化酶对酪胺降解率的影响；
[0033]图8是以ABTS为底物时，pH对重组多铜氧化酶酶活的影响；
[0034]图9是重组多铜氧化酶在含食品基质的模拟体系中对生物胺的降解率。
具体实施方式
[0035]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。
[0036]下述各例中采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0037]以下实施例所述乳酸菌多铜氧化酶的名称为Ls1b。
[0038]多铜氧化酶酶活测定方法如下：
[0039]采用可见光吸收法测定多铜氧化酶活力：以2,2'
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联氮
‑
双
‑3‑
乙基苯并噻唑啉
‑6‑
磺酸(ABTS)为底物，通过检测酶氧化ABTS的量计算本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降解食品中生物胺的方法，其特征在于，利用来源于清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)的多铜氧化酶降解生物胺，所述多铜氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述多铜氧化酶添加至含有组胺、酪胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺的体系中，所述生物胺的含量为50～200mg/L；所述酪胺、腐胺、色胺、苯乙胺、亚精胺、尸胺和精胺的含量优选为50～100mg/L。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶按照体系中每毫克生物胺添加不少于0.14U的量添加。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，反应体系中的乙醇含量为0～20％、氯化钠浓度为0～10％。5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪超凡，赵云松，韩静，梁会朋，张素芳，林心萍，陈映羲，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：