一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种抗人KL

【技术实现步骤摘要】
一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法


[0001]本专利技术具体涉及一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。

技术介绍

[0002]KL-6对判断Ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。若肺部基底膜的损害，可致血管通透性增加，使KL-6入血。血清中KL-6可反映肺泡损伤，II型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。KL-6水平能敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度。近年的多项研究报道了KL-6高水平表达可能与间质性肺疾病、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联,其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙,从而影响纤维化的发生和发展。
[0003]目前，传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况下非常有效，但是对血浆中的这些糖蛋白抗体的产生，传统的方法往往存在一定的不足，因为具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得，而且糖蛋白的抗原一般都不强，原核表达的蛋白不具有糖基化的修饰，免疫出的抗体往往不能很好的识别血液中的糖蛋白。糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原，采用传统的抗体生产方法进行抗体制备。但是这样不仅工序复杂，而且所需要的血清很难大量获得且含量很低，这对于纯化的糖蛋白并不合适。而且更重要的是，经过一系列的纯化过程可能会对糖蛋白造成影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术第一方面提供一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体。
[0007]优选地，其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫，待效价≥20000后，将多肽与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫加强。
[0008]进一步优选地，所述外源基因为C端融合有GFP基因的人KL-6基因。
[0009]更为优选地，所述的人KL-6基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]更为优选地，所述的人KL-6基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]进一步优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0012]优选地，所述的带有外源目的基因的稳定细胞株通过将所述外源基因瞬时转染CHO细胞制得。
[0013]进一步优选地，所述瞬时转染为电击转染，转染条件为电压150～170V,时间20～30ms，电压为方形波电压。
[0014]进一步优选地，在所述瞬时转染46～52小时后进行小鼠免疫。
[0015]本专利技术第二方面提供一种所述的制备方法制得的能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体在试剂盒中的应用。
[0016]本专利技术中，使用的CHO细胞为上皮贴壁型细胞，具有不死性，可以传代百代以上。另外，CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利，哺乳动物细胞表达可形成有活性的二聚体，具有糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的理想宿主。
[0017]本专利技术对标签蛋白绿色荧光蛋白GFP的引入同时考虑到三个方面的因素：1.由于GFP基因是融合在KL-6基因的C端，并不会对蛋白的分泌有所影响。2.在整个转染、感染和筛选的过程中，在荧光显微镜下可以直接观测到绿的荧光，可以免除了细胞裂解后进行的表达确认检测。3.作为一种载体蛋白，GFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫，类似于多肽交联于BSA蛋白产生的作用。
[0018]本专利技术使用瞬转后培养48h后进行免疫小鼠，因为在转染后48h细胞的表达量达到最高，增加抗体的产生。在效价达到20000的时候，采用多肽来进行免疫位点强化，加强区域的免疫应答。通过转染细胞免疫后进行配合肽位点的强化，极大的提高了免疫效率和免疫应答，使抗体的迅速上升但不会降低抗体的质量，是一种节约大量成本且极大提高免疫效率的方法。
[0019]本专利技术人以KL-6为例，建立了一套真核表达糖蛋白，并结合多肽来进行免疫位点强化的高效免疫体系，以获得高活性和高质量、低成本的抗体。将外源的糖蛋白基因与GFP融合之后在CHO细胞中通过瞬时转染表达，并将转染后的细胞用于小鼠免疫，在后续的免疫中加入多肽来进行免疫位点的强化，最后选取阳性血清老鼠，进行融合，通过多次筛选，获得高质量、高亲和性的抗体，该抗体可以特异性识别外源糖蛋白的。此方法与传统生产单克隆抗体的方法具有非常明显的优势，因为瞬间过程简单，并获得具有正确的糖基化修饰的蛋白，也解决了糖蛋白富集和难以纯化的难题。我们使用该方法成功的生产了KL-6的抗体。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0021]使用本专利技术的抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，成功的生产了高活性、高质量的KL-6蛋白抗体，且本专利技术的制备方法简单、高效、成本低。
附图说明
[0022]附图1：本专利技术的KL-6-GFP质粒电瞬转染CHO细胞后的荧光显微镜图；
具体实施方式
[0023]下面结合具体的相关实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。但是所描述的实施例仅为本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域的普通技术人员在未做出创造性的劳动前提下所获得的所有其它实施例都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法。如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
[0024]实施例1
[0025]稳定表达并分泌KL-6蛋白的细胞株的构建
[0026]根据已公布的人KL-6的基因进行真核密码子优化后全序列合成KL-6(24-224aa)-GFP(SEQ ID NO：1)基因，将KL-6(24-224aa)-GFP基因连接到质粒pcDNA3.1上，选用的酶切
位点是Hind III和Bam HI，化学转化感受态细胞Ecoli DH5α，挑单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。
[0027]使用天根质粒大量抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP117)对KL-6-GFP质粒进行大量抽提，过程如下：取100ml(过夜培养的菌液加入离心管，室温下8,000rpm(～8,228
×
g)离心3min收集细菌，尽量吸除上清，向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml裂解液，向离心管中加入8ml溶液中和液，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8,000rpm(～8,228
×
g)离心5-10min，使白色沉淀离至管底，向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇来沉淀DNA，通过吸附柱吸附，再洗涤吸附柱后将KL-6-GFP质粒洗脱。
[0028]将上述提取好的KL-6-GFP质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人KL-6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：使用免疫法制备能够特异性识别血浆蛋白的KL-6的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：其将带有外源目的基因的稳定细胞株与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫，待效价≥20000后，将多肽与弗氏完全佐剂混合后，对小鼠进行免疫加强。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述外源基因为C端融合有GFP基因的人KL-6基因。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的人KL-6基因的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的人KL-6基因的氨基酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：许旭旭，魏元基，蒋理国，
申请(专利权)人：张家港博泽利斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：