一种人神经调节蛋白4的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人神经调节蛋白4的制备方法，包括优人神经调节蛋白4编码基因的优化、合成、克隆、表达筛选、培养、纯化融合蛋白、酶切，得到人神经调节蛋白4蛋白。本发明专利技术目标蛋白表达量高，达到30％，表达产物具有正确的空间结构，纯化工艺采用的是常压柱层析技术和水溶液流动相，收率高于合成法，环境污染少。本发明专利技术获得的人神经调节蛋白4经过酶切去除了标签蛋白，产物具有天然氨基酸序列。天然氨基酸序列。天然氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
一种人神经调节蛋白4的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种人神经调节蛋白4的制备方法。

技术介绍

[0002]神经调节蛋白(neuregulin，NRG)是一类在神经系统、心脏、乳腺等组织和器官中介导细胞与细胞间信号转导的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)，是表皮生长因子受体(EGFR)络氨酸激酶家族的一个重要配体。哺乳类动物NRGs家族有四种NRG因子、即NRG1、NRG2、NRG3和NRG4，均可编码相应的EGF类似区域与酪氨酸激酶家族ErbBs(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homologs) 胞外区域结合，引起ErbBs形成二聚体，激活细胞内的信号转导，如磷脂酰肌醇激酶 3(phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K)和促细胞分裂蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)信号通路等，具有促进细胞生长、分化、迁移、凋亡和黏附的作用。
[0003]人神经调节蛋白4(neuregulin 4，NRG4)NRG4是NRG家族的成员之一，位于人类染色体15q24。和其它NRG家族成员(NRG1、2、3)一样，在神经系统均有表达，但仅NRG4表达在一些特定的外周组织，如肺、肝脏、心脏以及脂肪组织等，其中以棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)表达水平最高，主要在棕色脂肪组织细胞中表达和分泌。NRG4有5种基因产物，即NRG4A1、NRG4A2、NRG4B1、NRG4B2和 NRG4B3，这些表达产物有相同的翻译起始位点，其中两种变异体-NRG4A1和 NRG4A2有相同的跨膜区并且编码具有相同生物活性的片段。该片段包括了EGF结合位点，因而具有生物学活性。其余3种NRG4变异体(NRG4B1～3)由于缺失了用于跨膜的第6个外显子而只能存在于细胞内，并且因为缺失了C末端2个半胱氨酸而仅具有部分EGF结构，因此不能与相应受体结合而缺乏生物学活性。
[0004]NRG4在相应组织的细胞中生成，经蛋白水解后，具有EGF结合位点的胞外片段作为活性蛋白释放入血，以自分泌、旁分泌或者是内分泌形式作用于靶器官。不同的NRGs呈现出明显的特异性。与不同的ErbB受体有不同的亲和力，最终形成不同的二聚体、信号和细胞响应。NRG4只特异性地与ErbB4结合，ErbB4形成的同源二聚体是介导NRG4信号路径的有效受体，可通过下游PI3K/Akt、STAT5磷酸化等路径影响细胞凋亡和脂质代谢等功能。在蛋白酶小体抑制剂MG-132的存在下，两种蛋白的表达显著稳定，表明它们通常被该系统降解。
[0005]NRG4的N端包含带有胞外EGF类似区域的跨膜结构，可特异性地与细胞膜表面的EGF受体ErbB4结合，激活细胞内的信号传导，发挥其刺激细胞增殖、抑制细胞凋亡以及改善细胞能量代谢等生理学功能。越来越多的研究表明NRG4在上皮细胞相关疾病、心血管疾病、多部位肿瘤以及糖脂代谢相关疾病中发挥重要的作用，因此有可能成为多种疾病潜在的治疗靶点。
[0006]NRG4处理可阻断TNF和IFN-γ诱导的小鼠结肠上皮细胞凋亡。在小鼠实验性结肠炎模型中也有保护作用。NRG4刺激ErbB4的磷酸化，而不是其他ErbB受体，表明这是一种特异性反应。此外，与相关配体相比，NRG4增强了细胞存活而不是增殖或迁移，并刺激了抗凋亡介质Akt的磷酸化而不是ERK-MAPK的磷酸化。药物抑制 PI3K/Akt信号转导逆转了NRG4的
抗凋亡作用，证实了该级联反应在NRG4诱导的细胞存活中的作用。NRG4在人类炎症性肠病样本和小鼠结肠炎模型中的表达降低，表明ErbB的激活在疾病中发生了改变。因此，外源性NRG4可能有利于发生上皮细胞凋亡的疾病。用NRG4选择性激活erb4可能引起不同的细胞结果，这与其他EGF样或EGF受体调节蛋白家族分子刺激效应不同。
[0007]研究发现，在EGFR、ErbB2或ErbB3未检测到磷酸化的情况下，ErbB4的激活导致体外和体内抗凋亡信号的增强，细胞增殖或迁移没有改变。NRG4诱导的凋亡抑制依赖PI3K/Akt途径。因此，用NRG4选择性激活ErbB4似乎是一种特殊的细胞存活刺激。与其他生长因子相比，NRG4能够阻止细胞因子刺激的结肠上皮细胞凋亡，并降低了增殖障碍的风险，这使得它成为一种有吸引力的潜在治疗方法，用于治疗IBD等涉及小肠或结肠上皮细胞凋亡升高的疾病。
[0008]Hayes N.V.等在一组前列腺癌的研究(Endocr Relat Cancer.2010 Dec 13；18(1)：39-49. Expression of neuregulin 4 splice variants in normal human tissues and prostate cancer andtheir effects on cell motility)中发现，每种形式都有不同程度的表达，主成分分析表明有三种表达模式。一些异构体与前列腺特异性抗原水平呈正相关，其他异构体与 Gleason评分呈负相关。在伤口愈合实验中表达ErbB4(CTa)受体的细胞，合成复性的NRG4 A型促进片足和丝状足形成，并刺激细胞运动。数据表明，不同的形态有不同的表达和功能位点，这包括对细胞结构和运动的影响。
[0009]Steven J.等的研究(The American Journal of Pathology，Vol.184，No.10，October2014，The ErbB4 Ligand Neuregulin-4 Protects against Experimental NecrotizingEnterocolitis)显示NRG4及其受体ErbB4分别存在于母乳和发育中的小肠，这些发现与小肠疾病具有潜在临床相关性。NRG4-ErbB4信号可能是坏死性小肠结肠炎(NEC 治疗干预或预防的新途径。
[0010]Chengfu Cai1等通过对1212名男性腰围大于90厘米或女性腰围大于80厘米的肥胖成人(40岁或40岁以上)的血清Nrg4测定研究(BMC Medicine(2016)14：165， Association of circulating neuregulin 4 with metabolic syndrome in obese adults：across-sectional study)发现，循环中Nrg4浓度与肥胖中国成年人发生代谢综合征MetS 的风险呈负相关，提示循环Nrg4浓度可能是MetS发生的保护性因素。另一项研究也发现循环Nrg4浓度与肥胖人群亚临床动脉粥样硬化呈负相关，提示循环NRG4可能在确定心血管病高危患者中起作用。
[0011]EGF家族成员neuregulin(NRG)4在淋巴瘤细胞株中高表达。恶性淋巴瘤临床标本的免疫组化分析显示，NRG4和HER4主要表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人神经调节蛋白4的制备方法，包括优化人神经调节蛋白4的编码基因，合成基因，构建表达载体及转化大肠杆菌工程菌，筛选出阳性克隆，工程菌培养和表达，收集大肠杆菌菌体，破菌，纯化融合蛋白，其特征在于：(1)人神经调节蛋白4与标签蛋白相连，(2)纯化的融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切得到人神经调节蛋白4蛋白。2.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法，其特征在于：表达基因是SEQ.1的人神经调节蛋白4的DNA序列。3.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的制备方法，其特征在于：表达载体是pET系列载体质粒。4.根据权利要求1所述的一种人神经调节蛋白4的...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶楠，翁寿宝，郑妮宁，
申请(专利权)人：杭州俊丰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：