检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域的病毒检测方法，具体涉及一种检测野生型腺相关病毒的通用引物对/组合、检测方法及其应用。本发明专利技术提供一种可用于检测12种血清型的野生型腺相关病毒的通用引物对/组合，利用该引物组合，可实现12种血清型的野生型腺相关病毒的qPCR检测。相比传统的野生型腺相关病毒PCR检测方法，利用该引物组合的qPCR检测方法可有效提高检测灵敏度和准确性，更快捷、可定量。可定量。

【技术实现步骤摘要】
检测野生型腺相关病毒的通用引物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
的病毒检测方法，具体涉及一种检测野生型腺相关病毒的通用引物、检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)属于微小病毒科依赖病毒属B19家族，无包膜，含线性单链的脱氧核糖核酸—约4.7kbp，含rep和cap两个开放阅读框，两端分别有末端重复序列(ITR)。AAV颗粒呈二十面体，直经约20nm，分子量约为5.5-6.2
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106Da。目前没有直接证据表明AAV与人类疾病相关。AAV在宿主中的复制需要宿主细胞或其他病毒的协助才能完成，如腺病毒和疱疹病毒，因此被称为腺相关病毒。AAV是作为腺病毒的污染成分被发现的，FDA在《人体细胞和基因治疗指导原则》中对腺病毒生产的AAV污染残留的质量控制有明确规定。目前已发现的不同血清型、突变型AAV种类达上百种。过去，国内外在质量控制中主要采用PCR扩增常见腺相关病毒1-8血清型的保守序列来进行质量控制。如高凯等(高凯，毕华，丁有学等.重组复制型溶瘤腺病毒p53的质量控制方法.药学学报，2011,46(12)：1476-1482)，使用引物组合AAV-F1/R1对重组复制型溶瘤腺病毒p53中的AAV残留进行检测；李永红等(李永红，饶春明，赵阳等.重组腺病毒人内皮抑素的质量标准研究.中国肿瘤生物治疗杂志，2005,12(2)：138-142)使用引物组合Pan1/2对重组腺病毒人内皮抑素中的AAV残留进行检测。下载NCBI数据库中的AAV1-AAV12的序列进行比对与分析，推测，AAV-F1/R1对AAV3、5、11、12的扩增效率较低，Pan1/2对AAV3的扩增效率较低。
[0003]目前，尚未发现可快速高效、定量的检测12种血清型的野生型AAV(AAV1-12)的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种可用于检测12种血清型的野生型腺相关病毒的通用引物对/组合，利用该引物组合，可实现12种血清型的野生型腺相关病毒的qPCR检测。相比传统的野生型腺相关病毒PCR检测方法，利用该引物组合的qPCR检测方法可有效提高检测灵敏度和准确性，更快捷、可定量。
[0005]为此，本专利技术第一方面提供一种检测野生型腺相关病毒的通用引物对/组合。根据本专利技术的实施例，所述通用引物对/组合包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列为5
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tggtgggaggagggVaagatgac-3
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，其中简并碱基V为C、G或A；所述第二引物的序列为5
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，其中简并碱基R为G或A，简并碱基K为G或T。
[0006]国内外在腺病毒质量控制中主要采用PCR扩增常见腺相关病毒1-8血清型的保守序列来进行质量控制。目前尚未发现可快速高效、定量的检测12种血清型的野生型AAV(AAV1～12)的方法。而本专利技术提供的检测野生型腺相关病毒的通用引物，可同时用于检测12种血清型的野生型AAV。基于该引物组合开发的SYBR green I qPCR检测方法，其灵敏度
可达100个拷贝/反应，比此前传统的PCR检测方法提高至少1个数量级。
[0007]本专利技术第二方面提供一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，包含第一方面所述的通用引物对/组合。
[0008]本专利技术提供的包含所述第一引物和第二引物的试剂盒，可用于检测12种野生型腺相关病毒。
[0009]本专利技术第三方面提供第一方面所述的通用引物对/组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测野生型腺相关病毒。根据本专利技术的实施例，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。
[0010]本专利技术第四方面提供第一方面所述的通用引物对/组合或第二方面所述的检测试剂盒在检测野生型腺相关病毒中的应用。根据本专利技术的实施例，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。
[0011]本专利技术第五方面提供第一方面所述的通用引物对/组合在利用PCR或qPCR检测样品中野生型腺相关病毒的应用。根据本专利技术的实施例，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。
[0012]在本专利技术的一些优选的实施例中，利用qPCR检测样品中野生型腺相关病毒，相比传统的野生型腺相关病毒PCR检测方法，能够有效提高检测灵敏度和准确性，可定量且更快捷。
[0013]荧光定量PCR检测方法相对于PCR凝胶电泳鉴定方法通常具有更高的灵敏度、稳定性且更快捷、可定量。在本专利技术的一些实施例中，使用SYBR Green I qPCR方法利用通用引物进行野生型腺相关病毒检测。当然，基于本专利技术中通用引物也可以采用Taqman探针PCR检测方法进行野生型腺相关病毒检测。
[0014]本专利技术第六方面提供一种利用第一方面所述的通用引物对/组合的野生型腺相关病毒的qPCR检测方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括步骤：
[0015]1)提取待测样品中总DNA；
[0016]2)以总DNA为模板，利用所述通用引物进行qPCR扩增；
[0017]3)根据扩增结果，判定待测样品中是否存在野生型腺相关病毒，并对待测样品中野生型腺相关病毒的含量进行定量，
[0018]其中，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。
[0019]在本专利技术的一些实施例中，提取待测样品中总DNA可以采用本领域常规的提取DNA的方法，或者根据需要选择市售的基因组DNA提取试剂盒。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，还可以具有如下附加的技术特征：
[0021]在本专利技术的一些实施例中，进行qPCR扩增时的退火温度为50-60℃。而当退火温度不在此范围内时，如低于50℃，进行qPCR扩增则会产生非特异性扩增，影响后续待测样品中野生型腺相关病毒的含量的定量结果，若高于60℃，则扩增效率将降低。
[0022]在本专利技术的一些优选的实施例中，进行qPCR扩增时的退火温度为53-57℃。
[0023]在本专利技术的一些进一步优选的实施例中，进行qPCR扩增时的退火温度为54-56℃。
[0024]在本专利技术的一些更为优选的实施例中，进行qPCR扩增时的退火温度为55℃。
[0025]在本专利技术的一些实施例中，所述qPCR包括SYBR Green I qPCR和Taqman探针法
qPCR中的至少之一。
[0026]在本专利技术的一些优选的实施例中，利用第一方面所述的通用引物对/组合，通过SYBR Green I qPCR检测野生型腺相关病毒。该方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测野生型腺相关病毒的通用引物对/组合，其特征在于，包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列为5
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-tggtgggaggagggVaagatgac-3
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，其中简并碱基V为C、G或A；所述第二引物的序列为5
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-cRcacatgttKgtRttgg-3
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，其中简并碱基R为G或A，简并碱基K为G或T。2.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的通用引物对/组合。3.权利要求1所述的通用引物对/组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测野生型腺相关病毒，其中，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。4.权利要求1所述的通用引物对/组合或权利要求2所述的检测试剂盒在检测野生型腺相关病毒中的应用，其中，所述野生型腺相关病毒为12种血清型的野生型腺相关病毒，所述12种血清型的野生型腺相关病毒为AVV1～12。5.权利要求1所述的通用引物对/组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：林东，张玉蕊，刘兵，赵超，
申请(专利权)人：北京荷塘生华医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：