一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件制造技术

本发明专利技术提供了一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件。所述核酸纳米器件是以纳米金为载体，将核酸适配体及线粒体靶向分子与DNA四面体相结合而制得的。该纳米器件可将阿霉素定向递送至线粒体用于癌症治疗，且具有靶向性好、成本较低、效果显著的优势，在以线粒体为靶点的癌症精准治疗领域具有较高应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件


[0001]本专利技术属于纳米材料
，具体涉及一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件，其是将适配体、线粒体靶向分子与核酸自组装相结合，并以无机纳米粒子为载体制得的。

技术介绍

[0002]癌症严重威胁人类的生命健康，开发高效的癌症靶向治疗新技术刻不容缓。目前，化学药物已经广泛应用于癌症治疗，但具有缺乏靶向性、副作用明显等缺点。为了克服这些障碍，研究人员开发了一系列纳米载体用于递送化学药物，包括脂质体、纳米颗粒和聚合物等。这些纳米级药物递送系统可以提高靶标活性并优化药物在体内的分布，以平衡治疗效果和毒副作用之间的关系。但是仍然存在一些难以消除的弊端，主要包括以下方面：许多纳米载体只能将抗癌物质转运至细胞质，这存在一定的局限性，包括限制某些药物的治疗效果，例如蒽环类化疗药物，其作用位点在细胞核和线粒体等含有遗传物质的细胞器；其次，药物运输过程中的泄漏可能削弱治疗效果同时引起毒副作用。此外，不可避免的多药耐药性也是癌症治疗失败的重要原因。以上均表明单纯运输针对癌细胞或肿瘤组织的抗癌药物仍不能满足目前癌症治疗的需要，更精准的亚细胞器靶向递药成为一种很有前景的治疗策略。
[0003]线粒体是真核细胞内一种具有多种生理功能的重要细胞器，它参与能量代谢、钙稳态、氧化还原调节和细胞凋亡等。癌症的多种特征，包括合成代谢和增殖潜能增强、细胞凋亡和自噬受损以及对抗生长信号不敏感等，均与线粒体具有密切关系。线粒体在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。线粒体功能障碍可触发产生过量ROS以及线粒体膜电位降低，线粒体外膜通透性的变化导致细胞色素c 释放到细胞质中，释放的细胞色素c可激活细胞内Caspase家族蛋白酶，最终导致细胞凋亡。通过线粒体给药治疗癌症的可行性早已获得证实。靶向线粒体给药不仅可以减少药物副作用并提高疗效，还有助于克服多重耐药性，这使得线粒体靶向研究成为热点。许多线粒体药物递送纳米载体已被开发，截至2018年1月3日已有500多篇相关论文发表，由此可见线粒体靶向治疗的价值及潜力。虽然这些纳米载体克服了许多传统载体的缺点，但仍存在制备工艺繁琐、生物相容性低、载药效率不高及异质性等不足。
[0004]利用核酸自组装构建的DNA 纳米结构因多种突出的优势而被广泛用作抗癌药物载体，这些优势包括具有结构可编程性、负载量大、结构稳定、细胞内化能力强和生物相容性好等。其中，DNA 四面体作为一种性能优异的 DNA 纳米结构备受瞩目。它不仅制备过程简单，而且易于功能化，例如，它可以与多种功能分子包括适配体、多肽和DNAzyme等整合，用于癌症传感和治疗。四面体还可以作为结构单元构建纳米载体，由多个 DNA 四面体组成的 DNA 纳米线具有更大的载货量和更高的靶细胞亲和力。有研究人员在 DNA 四面体结构上修饰了阳离子两亲性肽（KLA）并成功获得一种可以靶向线粒体递送 Dox 的纳米结构，并证实了线粒体靶向治疗策略可以增强线粒体介导的细胞凋亡。以上反映了 DNA 四面体的
广泛适用性及其在线粒体靶向研究中的价值。另外，金纳米粒子 (AuNPs) 具有许多优点，包括良好的生物学和光电特性，易于共价或非共价修饰等，将DNA 纳米结构集成在金纳米粒子上可获得更好的靶向递药性能。
[0005]本专利技术利用金纳米粒子为DNA四面体和DNAzyme提供载体，提高了细胞内化能力。另外，本专利技术通过在DNA四面体上引入线粒体靶向分子三苯基膦（TPP）和AS1411适配体，使其获得癌细胞、线粒体双重靶向功能。本专利技术在肿瘤精准治疗方面具有较大应用潜力。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件的制备方法，其特征在于：其以纳米金为载体，将核酸适配体及线粒体靶向分子与DNA四面体相结合，从而制得一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件。
[0008]进一步的，上述一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件的制备方法具体包括以下步骤：（1）Au
‑
Bridge的制备：将30
ꢀµ
L 100
ꢀµ
M末端修饰巯基的寡核苷酸序列在4
ꢀµ
L10 mM的三（2
‑
羧乙基）膦溶液中室温下还原反应1h；将反应液添加到1 mL 3 nM的纳米金溶液（纳米金粒径为20 nm）中并充分混合，室温反应16 h；向反应液中添加终浓度为0.01M pH7.4的PB缓冲液，随后分3次向反应液中添加终浓度为0.3 M的NaCl溶液；将反应液离心，弃上清，将沉淀重悬于pH7.4的TAMg缓冲液重悬中；再重复2次离心重悬步骤，得到Au
‑
Bridge溶液；（2）Locked
‑
DNAzyme的制备：将9 μL 10 μM的锁链溶液与6 μL 10 μM DNAzyme分子链溶液混合，向其中加入pH7.4的TAMg缓冲液以补足混液总体积至50
ꢀµ
L；将混液置于95 ℃加热5 min，随后缓慢冷却至室温，得到Locked
‑
DNAzyme溶液；（3）DNA四面体的制备：将浓度均为10
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M的S1
‑
AS1411溶液、S2溶液、S3
‑
TPP溶液、S4溶液各取6
ꢀµ
L，混合，向其中加入pH7.4的TAMg缓冲液以补足混液总体积至50
ꢀµ
L；将混液置于95 ℃加热5 min，随后在54 ℃中保持30 min，最后快速降温至4 ℃，得到DNA四面体溶液；（4）核酸纳米器件的组装：将200
ꢀµ
L 3 nM的Au
‑
Bridge溶液与50
ꢀµ
L 1.2
ꢀµ
M的Locked
‑
DNAzyme溶液混匀，置于室温保存4 h；将混液离心，弃上清，将沉淀重悬于 pH7.4的TAMg缓冲液中；再重复1次离心重悬步骤；向重悬液中加入50
ꢀµ
L 1.2
ꢀµ
M的DNA四面体溶液并混合均匀，室温下静置4 h；将反应液离心，弃上清，将沉淀重悬于pH7.4的TAMg缓冲液中，即得到所述核酸纳米器件溶液。
[0009]其中，所述末端修饰巯基的寡核苷酸序列（桥链）为：5
’‑
TTATTATCTTATCATGTGCGCTCTATCTAT/rA/GGAAGTACCGCCGCTTTT
‑
SH
‑3’
；所述S1
‑
AS1411的核苷酸序列为： 5
’‑
CCAGGCAGTTGAGTCGAACATTCCTAAGTCTGAAATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCATTTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件的制备方法，其特征在于：其以纳米金为载体，将核酸适配体及线粒体靶向分子与DNA四面体相结合，从而制得一种具有癌细胞及线粒体双靶向性的核酸纳米器件。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：1）Au
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Bridge的制备：将30
ꢀµ
L 100
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M末端修饰巯基的寡核苷酸序列在4
ꢀµ
L 10 mM的三（2
‑
羧乙基）膦溶液中室温下还原反应1h；将反应液添加到1 mL 3 nM的纳米金溶液中并充分混合，室温反应16 h；向反应液中添加终浓度为0.01M pH7.4的PB缓冲液，随后分3次向反应液中添加终浓度为0.3 M的NaCl溶液；将反应液离心，弃上清，将沉淀重悬于pH7.4的TAMg缓冲液重悬中；再重复3次离心重悬步骤，得到Au
‑
Bridge溶液；2）Locked
‑
DNAzyme的制备：将9
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L 10
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M的锁链溶液与6
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L 10
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M DNAzyme分子链溶液混合，向其中加入pH7.4的TAMg缓冲液以补足混液总体积至50
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L；将混液置于95 ℃加热5 min，随后缓慢冷却至室温，得到Locked
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DNAzyme溶液；3）DNA四面体的制备：将浓度均为10
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M的S1
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AS1411溶液、S2溶液、S3
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TPP溶液、S4溶液各取6
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L，混合，向其中加入pH7.4的TAMg缓冲液以补足混液总体积至50
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L；将混液置于95 ℃加热5 min，随后在54 ℃中保持30 min，最后快速降温至4 ℃，得到DNA四面体溶液；4）核酸纳米器件的组装：将200
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L 3 nM的Au
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Bridge溶液与50
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L 1.2
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M的Locked
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DNAzyme溶液混匀，置于室温保存4 h；将混液离心，弃上清，将沉淀重悬于 pH7.4的TAMg缓冲液中；再重复1次离心重悬步骤；向重悬液中加入50

【专利技术属性】
技术研发人员：吴再生，孙树娟，阳娅，江豪，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：