新型昆虫抑制蛋白制造技术

公开了对鳞翅类害虫的种表现出毒性活性的杀虫蛋白，并且包括但不限于TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL。提供了含有编码一种或多种公开的杀虫蛋白的重组核酸序列的DNA构建体。提供了抗鳞翅类侵袭的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其含有编码本发明专利技术的所述杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于检测生物样品中本发明专利技术的重组核酸序列或蛋白质的存在的方法，以及使用TIC6757、TIC6757PL、TIC7472、TIC7472PL、TIC7473和TIC7473PL杀虫蛋白中的任一种来防治鳞翅类种的害虫的方法。任一种来防治鳞翅类种的害虫的方法。

【技术实现步骤摘要】
cutworm)(Striacosta albicosta)和绒毛豆夜蛾(Velvetbean caterpillar)(Anticarsia gemmatalis)。
[0010]历史上，依赖于合成化学杀虫剂的广泛应用来作为农业中的害虫防治剂。除了出现的抗性问题外，对环境和人类健康的担忧激发了生物杀虫剂的研发。这项研究工作导致逐渐发现和使用各种昆虫病原性微生物物种，包括细菌。
[0011]当昆虫病原性细菌，特别是属于芽孢杆菌属的细菌的潜力被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治范例发生了转移。细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，这是因为发现Bt菌株对特定昆虫具有高毒性。已知Bt菌株产生δ
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内毒素，其在孢子形成开始时和静止生长期期间位于伴孢结晶包涵体内(例如Cry蛋白质)，并且也已知其产生分泌的杀虫蛋白。在被易感昆虫摄食后，δ
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内毒素以及分泌毒素在中肠上皮表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破裂和死亡。编码杀虫蛋白的基因也在除Bt以外的细菌物种中被鉴定出来，包括其他芽孢杆菌属和多种其他细菌物种，例如侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus，“Ls”，以前称为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus))和日本甲虫类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae)。
[0012]结晶和分泌的可溶性杀虫毒素对它们的宿主是高度特异性的并且作为化学杀虫剂的替代物已经获得全世界的认可。例如，杀虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵袭，减少对化学杀虫剂应用的需求并提高产量。通过机械方法，例如喷洒以将含有各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，以及通过使用遗传转化技术产生表达杀虫毒素蛋白的转基因植物和种子，杀虫毒素蛋白被用于防治作物植物的农业相关害虫。
[0013]表达杀虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经在全球范围内适用。例如，2012年，有2610万公顷种植了表达Bt毒素的转基因作物(James,C.,Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops:2012.ISAAA Brief No.44)。转基因防虫作物的全球使用和这些作物中使用的有限数目的杀虫毒素蛋白为赋予对目前使用的杀虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因产生了选择压力。
[0014]目标害虫对杀虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀虫毒素蛋白的持续需求，所述新型杀虫毒素蛋白可用于管理对表达杀虫毒素蛋白的转基因作物的昆虫抗性的增加。新的蛋白毒素具有改善的效力并且对更广泛的易感昆虫种类表现出防治，这将减少可发展抗性等位基因的存活昆虫的数量。另外，在一个植物中使用两种或更多种对相同害虫有毒性并显示不同作用方式的转基因杀虫毒素蛋白，降低了在任何单个目标昆虫物种中的抗性的可能性。
[0015]因此，专利技术人在本文中公开了对以下物种表现出杀虫活性的来自日本甲虫类芽孢杆菌的新型蛋白毒素家族，以及类似毒素蛋白、变体蛋白和示例性重组蛋白：鳞翅类的种，特别是莎草粘虫(Spodoptera exempta)、秋菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、玉米穗虫((Helicoverpa zea)、棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea)、菱纹背蛾(Plutella xylostella)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、Cry1Fa1抗性草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、旧世界棉铃虫(OWB,Helicoverpa armigera)、南部夜蛾(Spodoptera eridania)、大豆尺夜蛾(Chrysodeixis includens)、斑
纹钻夜蛾(Earias vittella)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、烟斜纹夜蛾(Spodoptera litura，也称为群毛虫)、西方豆夜蛾(Striacosta albicosta)和绒毛豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。

技术实现思路

[0016]本文公开了一组新型的具有昆虫抑制活性的杀虫蛋白(毒素蛋白)，在本文称为TIC6757、TIC7472和TIC7473，属于TIC6757蛋白毒素类别，其对作物植物的一种或多种害虫表现出抑制活性。TIC6757蛋白和TIC6757蛋白毒素类别中的蛋白质可以在制剂中和在植物中(in planta)单独使用或与其他杀虫蛋白和毒性剂组合使用，从而提供了目前农业系统中使用的杀虫蛋白和杀虫剂化学物的替代品。
[0017]在一个实施方案中，本申请公开了重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子片段，其中：(a)所述杀虫蛋白包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18的氨基酸序列；或(b)所述杀虫蛋白包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18具有至少85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(c)所述多核苷酸区段与具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的多核苷酸杂交；或(d)编码杀虫蛋白或其片段的所述多核苷酸区段包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的核苷酸序列具有至少65％、或70％、或75％、或80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％序列同一性的多核苷酸序列；或(e)所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。重组核酸分子可以包含用于在植物中表达杀虫蛋白的序列；或在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的杀虫蛋白。
[0018]本申请的另一个实施方案中是包含本申请的重组核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和植物细胞。考虑的细菌宿主细胞包括土壤杆菌属(A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组核酸分子，其包含与编码杀虫蛋白的多核苷酸区段可操作地连接的异源启动子，其中所述杀虫蛋白包含与选自下组的序列具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。2.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中：a.所述重组核酸分子包含用于在植物中表达所述杀虫蛋白的序列；或b.所述重组核酸分子在不可再生的植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白；或c.所述重组核酸分子与载体可操作地连接，并且所述载体选自质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒和细菌或酵母人工染色体。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其限定为存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自细菌细胞和植物细胞。4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自以下的细菌属：土壤杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯菌属、泛菌属和欧文氏菌属。5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属的种是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠杆菌。6.如权利要求2所述的重组核酸分子，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。7.如权利要求6所述的重组核酸分子，其中所述植物宿主细胞选自苜蓿、香蕉、大麦、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、粟、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、稻、根茎、黑麦、红花、高粱、南方松、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、小黑麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白质表现出针对鳞翅类昆虫的活性。9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅类昆虫选自：绒毛豆夜蛾、甘蔗螟虫、小玉米茎蛀虫、玉米穗虫、烟芽夜蛾、大豆尺夜蛾、莎草粘虫、草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、美国棉铃虫、东方叶虫、棉红铃虫、秋菜夜蛾、西南玉米螟、棉叶波纹夜蛾、菱纹背蛾、斑纹钻夜蛾、烟斜纹夜蛾、西方豆夜蛾和欧洲玉米螟。10.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。11.如权利要求10所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码至少一种不同于所述杀虫蛋白的其他杀虫剂的核苷酸序列。12.如权利要求11所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsRNA分子和辅助蛋白。13.如权利要求11所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫种的活性。14.如权利要求11所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫蛋白选自Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、
Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC4...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：