一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法，包括对包心芥种子进行播种培养、共培养、预培养、分化筛选和生根培养，而后进行炼苗。本发明专利技术的受体材料为包心芥，在前人的研究基础上，选取其子叶作为外植体，通过组织培养以及农杆菌介导法对植物遗传转化载体PBI101空载进行了遗传转化研究，其中没有成功转入基因的幼芽会因为kana的抗性筛选导致白化然后死去，存活下来的幼芽即是成功转入基因的外植体，将长出芽点的外植体的多余部分切下，转移到生根培养基里继续培养，以筛选出含有PBI101空载片段的转基因包心芥芽系，从而建立了一个农杆菌介导的包心芥的遗传转化体系。体系。体系。

【技术实现步骤摘要】
一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法


[0001]本专利技术涉及包心芥高效遗传转化
，具体涉及一种基于 农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法。

技术介绍

[0002]包心芥即结球芥菜，也被称为菜胆、潮州芥，属于十字花科芸 薹属蔬菜，为芥菜的一个变种。包心芥生育期较短、生长适应性较 强、产量高，其叶球及叶片即可食用，又可加工成酸菜，具有较高 的营养价值和产业价值。种质资源是种业科技创新的源头，育种技 术特别是生物技术的创新和运用是品种改良提质增效的重要手段。 当前以基因编辑为代表的生物技术已成为国际育种的前沿和核心， 而转基因、基因编辑等技术的运用需要高效、成熟的植物遗传转化 体系作为前提。目前，植物遗传转化体系已在多种作物上成熟应用， 为基因编辑的研究应用奠定了基础。在芸薹属作物中，芥菜类蔬菜 与白菜类蔬菜均较难实现植株再生和遗传转化。前人对茎瘤芥和根 用芥菜的遗传转化体系进行了探索，但诱导出转基因植株的频率很 低。目前，华中农业大学以叶用芥菜类型雪里蕻hau CMS的保持系 00
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102B为受体材料，以下胚轴为外植体，建立了一种农杆菌介导 的芥菜的遗传转化方法，转化效率可达20％以上。然而，已有研究 表明，基因型对芥菜类蔬菜的转化效率影响很大，由于不同变种， 甚至不同品种之间基因型差别很大，即使在同一条件下，遗传转化 的效率也大不相同，甚至有可能完全诱导不出转基因植株。目前， 以包心芥为受体材料的遗传转化方法尚未建立。本专利技术可以实现对 包心芥基因组的定点突变，更好的提高包心芥的产量、品质和抗性， 在为利用基因编辑等生物技术实现包心芥种质资源创新和利用及品 种定向改良等方面起着至关重要的作用。
[0003]此外，在现阶段的关于进行农杆菌介导的芥菜的遗传转化，多 是以外植体是否长出芽点作为判断转化是否成功的依据，这种判断 方法不够完善。因此本研究以包心芥品种水东芥菜19B
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jnsd作为研 究对象，在前人的研究基础上，选取其子叶作为外植体，以PBI101 为载体提出有别于其他芥菜遗传转化方法的基于农杆菌介导法的包 心芥高效遗传转化方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗 传转化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的以外植体是否长出芽点 作为判断转化是否成功的依据，不够完善的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于农杆菌 介导法的包心芥高效遗传转化方法，包括S1.播种培养：优选包心芥 种子备用，进行无菌处理后播种在播种培养基上，光照培养；
[0006]播种培养基：MS 519 4.43g/L蔗糖20g/L，琼脂9.3g/L,并用2 mol/L NaOH溶液调节pH到5.7
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5.9之间；
[0007]S2.共培养：选取包心芥幼苗，在MS液中将子叶切下作为外植 体，将农杆菌接种到液体共培养基中，震荡过夜，使用液体播种培 养基重悬，选取子叶接种到铺有灭菌滤纸的共培养基中黑暗培养2d；
[0008]共培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA；
[0009]S3.预培养：将共培养两天的子叶转移到预培养基中；
[0010]预培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L AgNO3+200mg/L T；
[0011]S4.分化筛选：将长势仍良好的子叶接种到分化筛选培养基里进 行分化筛选培养；
[0012]分化筛选培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA+30mg/L Kan+0.5mg/L AgNO3+200mg/L T；
[0013]S5.生根培育：没有成功转入基因的幼芽会因为kana的抗性筛选 导致白化死去，存活下来的幼芽即是成功转入基因的外植体，将长 出芽点的外植体的多余部分切下，转移到生根培养基里继续培养；
[0014]生根培养基：MS0+0.2mg/L NAA+200mg/L T。
[0015]在本专利技术的一种实施例中，S1中，选包心芥种子的具体步骤为： 用镊子去除杂质及劣质种子，用两层干净的纱布将选好的种子包好， 绑上橡皮筋备用。
[0016]在本专利技术的一种实施例中，S1中，无菌处理的具体步骤为：将 纱布包裹的包心芥种子浸泡到0.1％HgCl2溶液中消毒9min，用灭 过菌的镊子不断搅拌使种皮与溶液充分接触，将种子放入无菌水中 清洗2min，需要用无菌水重复清洗3次。
[0017]在本专利技术的一种实施例中，S1中包心芥种子在25℃光照下培养 5～7d，光照强度为2000lx，光周期为16h/d。
[0018]在本专利技术的一种实施例中，S2中震荡过夜以及后续的具体步骤 为：将含有PBI101空载的农杆菌接种到LB液体培养基中，取1.8ml 放入离心管中在28℃，200rpm震荡培养过夜，取出1ml菌液加入30ml 无抗生素的LB液体培养基中，在28℃，200rpm震荡培养24小时到 浑浊，用MS液体培养基重悬，调节侵染液OD值为0.1～0.2时，将 包心芥子叶浸入其中2min，用灭菌滤纸吸干多余菌液。
[0019]在本专利技术的一种实施例中，S3中子叶柄要插入到培养基中但子 叶不碰到培养基，下胚轴平放于培养基上，预培养时间为一周。
[0020]在本专利技术的一种实施例中，S4中分化培养的环境，在25℃光照 下培养约20d，光照强度为2000lx，光周期为16h/d。
[0021]在本专利技术的一种实施例中，在炼苗前的操作均在超净工作台上 进行。
[0022]综上所述，由于采用了上述技术，本专利技术的有益效果是：
[0023]本专利技术中，通过同时选取其子叶作为外植体，使得外植体转化 更加明显；通过利用kana的抗性筛选导致没有成功转化基因的幼芽 白化死去，使得判断的依据更加明显，进而筛选出含有PBI101空载 片段的转基因包心芥芽系，从而完善了农杆菌介导的建南水东包心 芥的遗传转化体系。
附图说明
[0024]图1为本专利技术的流程框图；
[0025]图2为本专利技术实施例分化筛选后白化死亡的实验品示意图；
[0026]图3为本专利技术实施例分化筛选后成功转化的实验品示意图；
[0027]图4为本专利技术包心芥播种示意图；
[0028]图5为本专利技术包心芥两片叶子期示意图；
[0029]图6为本专利技术共培养示意图；
[0030]图7为本专利技术预培养示意图；
[0031]图8为本专利技术分化培养示意图；
[0032]图9为本专利技术生根培养示意图；
[0033]图10为本专利技术PCR鉴定示意图。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面 将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案 进行清楚、完整地描述，显然，所描述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1.播种培养：优选包心芥种子备用，进行无菌处理后播种在播种培养基上，光照培养；播种培养基：MS 519 4.43g/L蔗糖20g/L，琼脂9.3g/L,并用2mol/L NaOH溶液调节pH到5.7
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5.9之间；S2.共培养：选取包心芥幼苗，在MS液中将子叶切下作为外植体，将农杆菌接种到液体共培养基中，震荡过夜，使用液体播种培养基重悬，选取子叶接种到铺有灭菌滤纸的共培养基中黑暗培养2d；共培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA；S3.预培养：将共培养两天的子叶转移到预培养基中；预培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/LAgNO3+200mg/L T；S4.分化筛选：将长势仍良好的子叶接种到分化筛选培养基里进行分化筛选培养；分化筛选培养基：MS0+2mg/L 6
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BA+0.2mg/L NAA+30mg/LKan+0.5mg/L AgNO3+200mg/L T；S5.生根培育：没有成功转入基因的幼芽会因为kana的抗性筛选导致白化死去，存活下来的幼芽即是成功转入基因的外植体，将长出芽点的外植体的多余部分切下，转移到生根培养基里继续培养；生根培养基：MS0+0.2mg/L NAA+200mg/L T。2.根据权利要求1所述的一种基于农杆菌介导法的包心芥高效遗传转化方法，其特征在于，S1中，选包心芥种子的具体步骤为：用镊子去除杂质及劣质种子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洁，孟秋峰，王毓洪，黄芸萍，任锡亮，高天一，安学君，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：