基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法技术

本发明专利技术公开了基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，通过酶联免疫分析、流式样品的制备与表达量的检测、免疫磁珠法富集小鼠脾脏中CD4+T细胞、实时荧光定量PCR检测作为实验手段明确cTfh细胞与乙肝疫苗长期免疫效果关联及调控作用，鉴定乙肝疫苗长期免疫应答中发挥辅助作用的cTfh细胞亚群，并阐明cTfh细胞调控乙肝疫苗长期免疫的分子机制，为进一步探明乙肝疫苗长期免疫调节机制奠定基础，目以cTfh细胞为研究切入点，突破既往相关研究长期禁锢于Th1、Th2细胞的局限，基于免疫学最新发现，选准靶细胞，提高研究针对性和研究效率。研究效率。

【技术实现步骤摘要】
基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法


[0001]本专利技术涉及乙肝疫苗
，具体为基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法。

技术介绍

[0002]乙型病毒性肝炎的病原为乙肝炎病毒，缩写为HBV，乙型肝炎病毒为DNA病毒。基因组是双链、环形、不完全闭合DNA。病毒最外层是病毒的外膜或称衣膜(envelope)，其内层为核心部分(core)，核蛋白即是核心抗原(HBcAg)，不能在血清中检出。HBsAg阳性者的血清在电子显微镜下可见3种颗粒，直径为22nm的圆形和丝状颗粒，还有较少的直径为42。的球形颗粒，又称为Dane氏颗粒，是完整的HBV颗粒。
[0003]鉴定与乙肝疫苗长期免疫关联cTfh细胞亚群不同抗原激发体液免疫应答中辅助B细胞的cTfh细胞亚群不同，不同细胞的辅助功效又有差异，据此项目推测这可能是导致不同疫苗引起长期免疫效果差异的关键因素之一，因此要阐明cTfh细胞与乙肝疫苗长期免疫效果关系，首先需明确效应cTfh细胞亚群，为此，分别通过接种人群关联研究、体外实验加以阐述，同时在体外混合淋巴实验中增加其它糖蛋白抗原对照，验证效应亚群对乙肝疫苗抗原反应的特异性，实验手段上以流式细胞术和实时定量PCR分别从蛋白和基因水平相互印证，确保鉴定的效应cTfh细胞亚群结果的真实性与特异性，明确cTfh细胞与乙肝疫苗长期免疫效果关联及调控作用，鉴定乙肝疫苗长期免疫应答中发挥辅助作用的cTfh细胞亚群，并阐明cTfh细胞调控乙肝疫苗长期免疫的分子机制，为进一步探明乙肝疫苗长期免疫调节机制奠定基础，目以cTfh细胞为研究切入点，突破既往相关研究长期禁锢于Th1、Th2细胞的局限，基于免疫学最新发现，选准靶细胞，提高研究针对性和研究效率。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，明确cTfh细胞与乙肝疫苗长期免疫效果关联及调控作用，鉴定乙肝疫苗长期免疫应答中发挥辅助作用的cTfh细胞亚群，并阐明cTfh细胞调控乙肝疫苗长期免疫的分子机制，为进一步探明乙肝疫苗长期免疫调节机制奠定基础。
[0005]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，包括酶联免疫分析、流式样品的制备与表达量的检测、免疫磁珠法富集小鼠脾脏中CD4+T细胞、实时荧光定量PCR检测。
[0006]优选的，所述酶联免疫分析包括如下步骤：
[0007](1)取预先冻存好的血清放置于4℃冰箱，进行解冻30分钟，3000rpm条件下离心20min，从而使颗粒状杂质沉淀，获得澄清均匀的血清。检测试剂盒室温平衡30min后从铝箔袋中取出所有的板条，截取所需要的部分，剩余板条密封放回4℃。
[0008](2)加样：50μL/孔各加入浓度依次为：80、40、20、10、5、2.5mIU/mL HBsAb的标准品，样品孔中加入待测样品50μL，空白孔不用添加。加样过程中需要将样品加入酶标板孔的
底部，注意避免碰触孔壁，随后轻柔地水平晃动摇匀。
[0009](3)加酶：除空白孔以外每孔加入辣根过氧化氢酶(HRP)标记的检测抗体50μL。
[0010](4)孵育：取封板膜，设置孵育箱为37℃，并放置60min。
[0011](5)洗涤液配制：取20
×
浓缩洗涤液，用超纯水稀释至1
×
后备用。
[0012](6)洗涤：撕开封板膜，甩出板内的液体，每孔加入350μL 1
×
洗涤液，静置1min后弃液体，纸上拍干液体，如此重复洗板5次。
[0013](7)显色：底物液A和B在使用前按1:1体积充分混合，混合后15min内使用，每孔加入100μL底物混合物，轻轻震荡混匀，用封板膜盖住反应板避光，37℃孵育15min。
[0014](8)终止：每孔加50μL的终止液，终止孔内的反应。
[0015](9)测定：设置酶标仪为450nm波长，测量每孔的吸光度(OD值)。
[0016](10)计算样品浓度：通过标准样的测量值制作标准曲线，计算回归方程，再利用方程算出每孔样品HBsAb浓度值。
[0017]优选的，所述流式样品的制备与表达量的检测包括如下步骤：
[0018](1)取1
×
106外周血单核细胞于1.5mL离心管中，用1mL Buffer溶液重悬细胞。
[0019](2)室温下300rcf进行10min离心溶液。
[0020](3)弃上清，再用100μL Buffer重悬细胞。
[0021](4)加流式抗体，用移液枪或者移液管轻轻吹打混匀，避光室温孵育30min。
[0022](5)孵育结束后加入1mL Buffer溶液进行细胞重悬。
[0023](6)室温下300rcf进行10min离心。
[0024](7)弃去上清，用400μL的2％多聚甲醛固定细胞，上机检测。
[0025]优选的，所述免疫磁珠法富集小鼠脾脏中CD4+T细胞包括如下步骤：
[0026](1)取PBMCs细胞以50μL/mL计算量加入EasySep
TM Mouse T Cell Enrichment Cocktail，充分混匀，室温(15
‑
25℃)孵育10min。
[0027](2)漩涡震荡EasySep
TM D Magnetic Particles 30s，确保溶液无聚集物。
[0028](3)再向流式管加入100μL的Magnetic Particles，充分混匀，室温(15
‑
25℃)孵育5min。
[0029](4)再向流式管(容积为3mL)中加入缓冲溶液，使液体总量达到2.5mL。
[0030](5)用移液枪上下混匀细胞2
‑
3次，将整个流式管插入磁铁内，放置5min。
[0031](6)轻轻地将载有磁铁的流式管倾倒，注入新的管中，将磁极和管子倒置2
‑
3s，然后返回直立位置。不需摇晃或擦掉任何可能悬挂在管口上的液滴，此即磁珠富集后得到的CD4+T细胞，鉴定纯度。
[0032]优选的，所述实时荧光定量PCR检测包括如下步骤：
[0033](1)引物合成：取mRNA目的引物，并根据使用说明书，用DEPC配置成浓度为100μM，放入
‑
20℃冰箱储存备用，使用时上下游引物各取10μL，DEPC取80μL稀释至10μM，以达到工作反应的浓度。
[0034](2)细胞内总RNA提取
[0035]S1.将T细胞转移到到1.5mL EP管中，4℃，2000rpm，离心5min，收集细胞，弃培养基。
[0036]S2.向细胞中加入1mL Trizol反应液，用移液器后移液管缓慢地吹打裂解细胞几
次，室温，静置5min，从本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，包括酶联免疫分析、流式样品的制备与表达量的检测、免疫磁珠法富集小鼠脾脏中CD4+T细胞、实时荧光定量PCR检测。2.根据权利要求1所述的基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，其特征在于，所述酶联免疫分析包括如下步骤：(1)取预先冻存好的血清放置于4℃冰箱，进行解冻30分钟，3000rpm条件下离心20min，从而使颗粒状杂质沉淀，获得澄清均匀的血清。检测试剂盒室温平衡30min后从铝箔袋中取出所有的板条，截取所需要的部分，剩余板条密封放回4℃。(2)加样：50μL/孔各加入浓度依次为：80、40、20、10、5、2.5mIU/mL HBsAb的标准品，样品孔中加入待测样品50μL，空白孔不用添加。加样过程中需要将样品加入酶标板孔的底部，注意避免碰触孔壁，随后轻柔地水平晃动摇匀。(3)加酶：除空白孔以外每孔加入辣根过氧化氢酶(HRP)标记的检测抗体50μL。(4)孵育：取封板膜，设置孵育箱为37℃，并放置60min。(5)洗涤液配制：取20
×
浓缩洗涤液，用超纯水稀释至1
×
后备用。(6)洗涤：撕开封板膜，甩出板内的液体，每孔加入350μL 1
×
洗涤液，静置1min后弃液体，纸上拍干液体，如此重复洗板5次。(7)显色：底物液A和B在使用前按1:1体积充分混合，混合后15min内使用，每孔加入100μL底物混合物，轻轻震荡混匀，用封板膜盖住反应板避光，37℃孵育15min。(8)终止：每孔加50μL的终止液，终止孔内的反应。(9)测定：设置酶标仪为450nm波长，测量每孔的吸光度(OD值)。(10)计算样品浓度：通过标准样的测量值制作标准曲线，计算回归方程，再利用方程算出每孔样品HBsAb浓度值。3.根据权利要求1所述的基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，其特征在于，所述流式样品的制备与表达量的检测包括如下步骤：(1)取1
×
106外周血单核细胞于1.5mL离心管中，用1mL Buffer溶液重悬细胞。(2)室温下300rcf进行10min离心溶液。(3)弃上清，再用100μL Buffer重悬细胞。(4)加流式抗体，用移液枪或者移液管轻轻吹打混匀，避光室温孵育30min。(5)孵育结束后加入1mL Buffer溶液进行细胞重悬。(6)室温下300rcf进行10min离心。(7)弃去上清，用400μL的2％多聚甲醛固定细胞，上机检测。4.根据权利要求1所述的基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫效果的实验方法，其特征在于，所述免疫磁珠法富集小鼠脾脏中CD4+T细胞包括如下步骤：(1)取PBMCs细胞以50μL/mL计算量加入EasySep
TM
Mouse T Cell Enrichment Cocktail，充分混匀，室温(15
‑
25℃)孵育10min。(2)漩涡震荡EasySep
TM
D Magnetic Particles 30s，确保溶液无聚集物。(3)再向流式管加入100μL的Magnetic Particles，充分混匀，室温(15
‑
25℃)孵育5min。(4)再向流式管(容积为3mL)中加入缓冲溶液，使液体总量达到2.5mL。
(5)用移液枪上下混匀细胞2
‑
3次，将整个流式管插入磁铁内，放置5min。(6)轻轻地将载有磁铁的流式管倾倒，注入新的管中，将磁极和管子倒置2
‑
3s，然后返回直立位置。不需摇晃或擦掉任何可能悬挂在管口上的液滴，此即磁珠富集后得到的CD4+T细胞，鉴定纯度。5.根据权利要求1所述的基于队列的cTfh细胞对乙肝疫苗长期免疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪茜，唐豪，倪进东，王小菊，周桑玉，熊泳珍，尹明娟，梁东梅，曾金妹，
申请(专利权)人：东莞市莞城医院，
类型：发明
国别省市：