用表达永生化蛋白的自我复制型RNA载体的细胞扩增制造技术

包含编码至少一种永生化蛋白的序列的合成的、自我复制型RNA载体，以及自我复制型RNA载体延长原代细胞群体的寿命和扩增所述原代细胞群体的用途。细胞群体的用途。细胞群体的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用表达永生化蛋白的自我复制型RNA载体的细胞扩增
[0001]相关申请本申请要求于2019年6月27日提交的美国优先权专利申请号62/867,505的优先权利益，所述美国优先权专利申请的全部内容整体引入本文。


[0002]本公开内容涉及用于扩增原代细胞群体的组合物和方法。

技术介绍

[0003]原代细胞直接从人组织或动物组织中分离。因此，它们更类似于体内状态并且显示出正常的细胞生理学。然而，原代细胞会死亡并且具有有限的寿命，即它们在一定次数的细胞分裂后停止分裂(或衰老)。永生化基因如端粒酶、细胞癌基因和病毒癌基因已用于原代细胞的永生化。然而，将这些永生化基因例如病毒癌基因整合到原代细胞的基因组内可改变原代细胞的完整性。用于使原代细胞可逆地永生化的手段将是非常有益的。

技术实现思路

[0004]在本公开内容的各个方面提供了编码一种或多种永生化蛋白的自我复制型RNA载体。一般而言，自我复制型RNA载体基于甲病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)，其中编码病毒结构蛋白的序列缺失并替换为编码至少一种永生化蛋白的序列。在一些实施方案中，至少一种永生化蛋白选自人端粒酶(hTert)、人乳头状瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)、人乳头状瘤病毒16型E7蛋白(HPV16 E7)、猿猴空泡病毒40大T抗原(SV40 LT)、cMyc
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T58A蛋白、同源框HoxB8蛋白、同源框HoxA9蛋白、同源框HoxA10蛋白、腺病毒E1A蛋白、腺病毒E1B蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)、Ras V12蛋白、多梳复合体蛋白Bmi1、hsp70成员9 (HSPA9)或其组合。
[0005]本公开内容的另一个方面提供了包含本文公开的任何自我复制型RNA载体的原代细胞。
[0006]本公开内容的另外一个方面包括编码本文公开的任何自我复制型RNA载体的质粒载体。
[0007]本公开内容的一个进一步方面提供了用于延长原代细胞群体中的寿命的方法，所述方法包括将本文公开的任何自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命。
[0008]本公开内容的再一个方面包括用于扩增原代细胞群体的方法，所述方法包括(a)将本文公开的任何自我复制型RNA载体引入原代细胞群体内，其中在至少一种永生化蛋白表达后，与未用自我复制型RNA载体转染和/或未暴露于至少一种永生化蛋白的对照原代细胞群体相比，所述原代细胞群体具有增加的寿命；并且(b)一旦原代细胞群体达到适当的细胞数量，就通过稀释和/或经由干扰素先天性免疫应答，从原代细胞群体中去除自我复制型
RNA载体。
[0009]下文更详细地描述了本公开内容的其它方面和迭代。
附图说明
[0010]专利或申请文件含有至少一个彩色绘制的附图。本专利或专利申请公开的具有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
[0011]图1呈现了显示本文公开的几种自我复制型RNA载体的结构的图示。
[0012]图2显示了在细胞经受衰老相关的β
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半乳糖苷酶染色方案后，模拟转染和RFP
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hTert转染的BJ成纤维细胞的图像。
[0013]图3呈现了RFP
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hTert (无E3L)转染和RFP
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hTert
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E3L转染的MSC的荧光(左)和明场(右)图像。
[0014]图4呈现了模拟转染、RFP
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hTert
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E3L转染、RFP
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hTert
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E6E7
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E3L转染和RFP
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htert
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T58A
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E3L转染的成人HEK细胞的明场图像。
[0015]图5A显示了在自我复制型RNA载体去除之前和之后，RFP
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hTert
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E3L转染、RFP
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hTert
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E6E7
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E3L转染和RFP
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htert
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T58A
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E3L转染的MSC的明场图像。
[0016]图5B示出了在指示的自我复制型RNA载体去除之前和之后，MCS标记物基因CD44和CD105的表达。
[0017]图6呈现了用指示的自我复制型RNA载体转染的HEK细胞的明场(左)和荧光+明场(右)图像。
[0018]图7A显示了通过流式细胞术测量的S
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ATG、S
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ATA、S
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ATC、S
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ATT、P
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ATG、P
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ATA、P
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ATC和P
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ATT的GFP表达。细胞在嘌呤霉素(P)、B18R蛋白(B)和鲁索替尼(R)的存在下培养4周。
[0019]图7B呈现了在第14天时S
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ATG、S
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ATA、S
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ATC、S
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ATT、P
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ATG、P
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ATA、P
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ATC和P
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ATT的GFP表达的荧光图像。
[0020]图8A显示了在HFF中通过流式细胞术在第1天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的所有20种氨基酸的GFP表达。
[0021]图8B显示了在HFF中通过流式细胞术在第7天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的14种氨基酸的GFP表达。
[0022]图8C显示了在HFF中通过流式细胞术在第14天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的14种氨基酸的GFP表达。
[0023]图8D显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第1天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的所有20种氨基酸的GFP表达。
[0024]图8E显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第7天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的8种氨基酸的GFP表达。
[0025]图8F显示了在NIH3T3细胞中通过流式细胞术在第14天时，使用ATC形式对于在nsP2
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773处的位置的8种氨基酸的GFP表达。
[0026]图9A呈现了在HFF中在用S
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ATG
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E6E7
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GFP2和W
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ATC
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E6E7
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GFP2转染本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基于甲病毒的自我复制型RNA载体，其中编码病毒结构蛋白的序列缺失并替换为编码至少一种永生化蛋白的序列。2. 权利要求1的自我复制型RNA载体，其中所述至少一种永生化蛋白选自人端粒酶(hTert)、人乳头状瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)、人乳头状瘤病毒16型E7蛋白(HPV16 E7)、猿猴空泡病毒40大T抗原(SV40 LT)、cMyc
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T58A蛋白、同源框HoxB8蛋白、同源框HoxA9蛋白、同源框HoxA10蛋白、腺病毒E1A蛋白、腺病毒E1B蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)、Ras V12蛋白、多梳复合体蛋白Bmi1、hsp70成员9 (HSPA9)或其组合。3. 权利要求2的自我复制型RNA载体，其中所述至少一种永生化蛋白选自hTert、HPV16 E6和HPV16 E7 (HPV16 E6
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E7)、SV40 LT、cMyc
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T58A或其组合。4. 权利要求1至3中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒为奥拉病毒、巴班肯病毒、巴马森林病毒、贝巴鲁病毒、Buggy Creek病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、大沼泽地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒、高地J病毒、Kyz病毒(Kyzylagach virus)、马亚罗病毒、米德尔堡病毒、穆坎布病毒、恩杜姆病毒、皮克孙纳病毒(Pixuna virus)、奥尼翁尼翁病毒(O'nyong
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nyong virus)、罗斯河病毒、鹭山病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、乌纳病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、西方马脑炎病毒或沃达罗河病毒(Whataroa virus)。5.权利要求4的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒是塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或VEE。6.权利要求4或5的自我复制型RNA载体，其中所述甲病毒是VEE。7.权利要求1至6中任一项的自我复制型RNA载体，其中编码所述甲病毒的非结构复制复合体蛋白的序列包含相对于野生型甲病毒的至少一个核苷酸变化。8.权利要求1至7中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码至少一种荧光蛋白的序列。9.权利要求1至8中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码至少一种可选择标记物的序列。10.权利要求1至9中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述载体进一步包含编码牛痘病毒E3L蛋白的序列。11. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert、HPV16 E6
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E7、SV40 LT或cMyc
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T58A的序列。12. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和HPV16 E6
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E7的序列。13. 权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和SV40 LT的序列。14.权利要求1至10中任一项的自我复制型RNA载体，其中所述RNA载体基于VEE病毒，并且包含编码hTert和cMyc
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T58A的序列。15.一种原代细胞，其包含权利要求1至14中任一项的自我复...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉冈直寿，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：