确定循环核酸的线性和环状形式制造技术

提供了用于分析生物样品中环状DNA的技术，其包括用限制性酶或转座酶切割以使环状DNA线性化，以便可以对其进行测序；使用一种或多种标准来鉴定线性化DNA分子；以及分析所鉴定的分子以测量所述生物样品的特性。定的分子以测量所述生物样品的特性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】确定循环核酸的线性和环状形式
相关申请的交叉引用
[0001]本申请是2019年3月25日提交的标题为“确定循环核酸的线性和环状形式(Determining Linear And Circular Forms of Circulating Nucleic Acids)”的美国临时专利申请第62/823,567号的非临时申请并要求其权益，所述美国临时专利申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。背景
[0002]染色体外环状DNA(eccDNA)是独立于染色体DNA存在的环状形式的DNA(Zhu等人,Sci Rep.2017；7(1):10968)。根据电子显微镜观察，它们首先在小麦和野猪DNA中发现(Hotta等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1965；53:356
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62)。后来的研究人员发现，这些形式的DNA广泛存在于所有有机体的组织中(Gaubatz.Mutat Res.1990；237(5
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6):271
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292)。此外，已经揭示可以在鼠(Kumar等人,Mol Cancer Res.2017；15:1197
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1205)和人类血浆(Zhu等人,Sci Rep.2017；7:10968)中检测到eccDNA。
[0003]已经在血浆中检测到线粒体DNA(Chiu等人,Clin Chem2003；49:719
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726和Lo等人,Sci Transl Med 2010；2:61
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ra91)。已经对癌症患者的血浆中的线粒体DNA进行了测量，但这些测量不一致(Yu M等人,Mitochondrial DNA 2012；23:329
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32；Zachariah RR等人,Obstet Gynecol 2008；112:843
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50；Mehra N等人,Clin Cancer Res 2007；23:421
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6；Kohler等人,Mol Cancer 2009；8:105；以及Choudhuri等人,Mol Cell Biochem 2014；386:259
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269)。概述
[0004]本公开内容的各种实施方案可以提供用于分析生物样品中的环状DNA的技术，所述生物样品可以包括细胞和/或无细胞DNA，如血浆。例如，为了测量环状DNA，可以进行切割以线性化环状DNA，从而可以对它们进行测序。示例切割技术包括限制性酶和转座酶。然后，可以使用一个或多个标准来鉴定线性化DNA分子，例如，以便与线性DNA分子区分开。一个示例标准是将一对反向末端序列映射到参考基因组。另一个示例标准是例如与限制性酶或通过转座酶加入的适配子序列相关的切割标签的鉴定。
[0005]一旦鉴定了环状DNA分子(例如，eccDNA和环状线粒体DNA)，就可以对它们进行分析(例如，以确定计数、尺寸概况和/或甲基化)，以测量生物样品的特性。示例特性包括检测染色体区域中的拷贝数畸变，其继而可以用于检测疾病(例如癌症)的水平。疾病水平可以直接，使用畸变，例如使用甲基化检测。另一个实例包括基于eccDNA的量鉴定细胞组织中的组织类型或疾病。
[0006]另外，一些实施方案可以提供同时分析短的线性和环状mtDNA分子的方法。例如，本公开内容允许(1)定量血浆DNA库中的线性和环状形式的无细胞mtDNA分子之间的相对量，例如，以确定疾病水平；以及(2)推断血浆DNA库中线性和环状mtDNA分子的来源组织，例如，作为确定非造血组织或造血组织是否具有序列变体的一部分。序列变体的鉴定可以进一步用于鉴定疾病(例如癌症)和关于该疾病的原始信息。
[0007]下面详细描述本公开内容的这些和其它实施方案。例如，其它实施方案涉及与本
文描述的方法相关的系统、装置和计算机可读介质。
[0008]参考以下详细描述和附图，可以获得对本公开内容的实施例的性质和优点的更好理解。附图简述
[0009]图1显示了根据本公开内容的实施方案的用于eccDNA鉴定的示例技术。
[0010]图2A和2B显示了根据本公开内容的实施方案的用于连接处搜索方法的示意性方法。
[0011]图3A
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5B显示了根据本公开内容的实施方案的一个妊娠病例(MspI处理的)的尺寸分析。
[0012]图6A
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7B显示了母体特异性eccDNA和胎儿特异性eccDNA(5例合并)的尺寸分析。
[0013]图8显示了eccDNA的基因组位置的注释。
[0014]图9显示了来自用MspI和HpaII处理的一个妊娠血浆样品的eccDNA的基因组位置。
[0015]图10A和10B显示了根据本公开内容的实施方案，使用基于转座酶的标签化(tagmentation)进行eccDNA鉴定的原理的实例。
[0016]图11显示了根据本公开内容的实施方案，使用标签化方案对eccDNA的尺寸分析。
[0017]图12显示了根据本公开内容的实施方案，通过酶促转化对eccDNA进行鉴定和甲基化分析的示例工作流程。
[0018]图13A和13B显示了根据本公开内容的实施方案，人类血浆中eccDNA的尺寸分析和累积频率。
[0019]图14比较了不同染色体中线性和eccDNA分子的甲基化水平。
[0020]图15显示了根据本公开内容的实施方案，通过亚硫酸氢盐转化对eccDNA进行鉴定和甲基化分析的示例工作流程。
[0021]图16是说明根据本公开内容的实施方案的用于分析环状核DNA的技术的流程图。
[0022]图17显示了根据本公开内容的实施方案的用于区分血浆中无细胞环状来源的和线性来源的mtDNA分子的示例技术。
[0023]图18说明了BfaI限制性酶证明多种原理的用途。
[0024]图19A和19B显示了根据本公开内容的实施方案，在具有和没有限制性酶(BfaI)消化的情况下血浆DNA的血浆mtDNA度量的比较。
[0025]图20显示了在不同处理下测序的mtDNA片段的尺寸概况。
[0026]图21A和21B显示了在所有常染色体和所有mtDNA中mtDNA>200bp的比例。
[0027]图22显示了针对图20中的酶促切割2020以及图18中的模拟结果的具有两个切割末端的mtDNA片段的尺寸概况。
[0028]图23显示了通过Pacific Biosciences单分子实时(Single Molecule Real
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Time，SMRT)测序平台测序的未经限制性酶处理的血浆DNA中的MtDNA片段。
[0029]图24A显示了根据本公开内容的实施方案，在具有或没有酶促切割处理的情况下血浆中mtDNA的比例之间的相关性。图24B显示了根据本公开内容的实施方案，在用酶促处理的血浆DNA的所有DNA(核和线粒体)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.方法，其包括：接收有机体的生物样品，所述生物样品包括多个染色体外环状DNA(eccDNA)分子，其中所述多个eccDNA分子中的每一个包括连接处，在所述连接处，两个分开的基因组位置处的核苷酸彼此直接相邻；切割所述多个eccDNA分子以形成一组线性化DNA分子，其各自包括所述连接处；对于所述一组线性化DNA分子中的每一个：对所述一组线性化DNA分子的至少两个末端进行测序以获得一个或多个序列读取；从所述一个或多个序列读取中选择所述线性化DNA分子的一对末端序列，所述一对末端序列不包括所述连接处；反转所述一对末端序列中的每一个的方向以获得一对反向末端序列；以及将所述一对反向末端序列映射到参考基因组；以及分析映射的反向末端序列以测量所述生物样品的特性。2.如权利要求1所述的方法，其还包括：基于映射到所述参考基因组的一对反向末端序列对所述多个eccDNA分子进行检测；以及确定检测到的eccDNA分子的集合值，其中分析所述映射的反向末端序列以测量使用所述集合值的生物样品的特性。3.如权利要求2所述的方法，其中所述集合值包括使用检测到的eccDNA分子确定的计数、尺寸或甲基化水平。4.如权利要求1所述的方法，其中，对于所述线性化DNA分子中的每一个，所述一个或多个序列读取包括所述连接处。5.如权利要求4所述的方法，其中分析映射的反向末端序列包括：将延伸超过所述映射的反向末端序列中的每一个的所述一个或多个序列读取中的碱基与参考基因组进行比较，直到鉴定出错配状况；以及基于所述参考基因组中错配状况的位置，鉴定形成eccDNA分子的线性化DNA分子的末端位置。6.如权利要求5所述的方法，其中分析所述映射的反向末端序列还包括：使用所述末端位置确定所述线性化DNA分子的尺寸。7.如权利要求6所述的方法，其中分析所述映射的反向末端序列还包括：确定针对所述多个eccDNA分子测量的尺寸的尺寸分布；以及使用所述尺寸分布来测量所述生物样品的特性。8.如权利要求1所述的方法，其中分析所述映射的反向末端序列包括：对映射到染色体区域的多个eccDNA分子的数目进行计数，其中所述生物样品的特性是所述染色体区域的特性；以及使用所述数目来测量所述染色体区域的特性。9.如权利要求8所述的方法，其中所述特性是所述染色体区域中的拷贝数畸变，所述方法还包括：使用所述生物样品中的DNA分子测量所述染色体区域中的甲基化密度；以及使用所述拷贝数畸变和所述甲基化密度来检测所述有机体的病况。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述甲基化密度通过与截止值进行比较而被确定为表现出高甲基化，并且其中所述病况是脆性X综合征或三联体重复扩增。11.如权利要求8所述的方法，其中所述染色体区域的特性是所述染色体区域携带关于所述生物样品的特性的信息或者具有所述生物样品中的畸变，其包括序列改变、翻倍、扩展、缺失或扩增。12.如权利要求11所述的方法，其中所述生物样品获自进行癌症筛查的对象，所述方法还包括：基于所述染色体区域具有所述畸变鉴定所述有机体中的癌症水平。13.如权利要求11所述的方法，其中所述生物样品获自怀有胎儿的女性，并且其中所述畸变在所述胎儿中。14.如权利要求11所述的方法，其中所述特性是性别或基因型信息。15.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括第一组织类型和第二组织类型，其中所述第一组织类型对于基因座处的第一等位基因是纯合的，并且其中所述第二组织类型对于所述基因座处的第一等位基因和第二等位基因是杂合的，所述方法还包括：确定在所述基因座处具有所述第一等位基因的映射的反向末端序列的第一数目；确定在所述基因座处具有所述第二等位基因的映射的反向末端序列的第二数目；以及使用所述第一数目和所述第二数目确定来自所述第二组织类型的eccDNA分子的分数浓度。16.如权利要求1所述的方法，其还包括：确定所述映射的反向末端序列中的序列变体的数目；以及使用所述序列变体的数目确定癌症水平。17.如权利要求1所述的方法，其还包括：在切割所述多个eccDNA分子之前，通过核酸外切酶消化来减少所述生物样品中的线性DNA。18.方法，其包括：接收有机体的生物样品，所述生物样品包括多个染色体外环状DNA(eccDNA)分子，其中所述多个eccDNA分子中的每一个包括连接处，在所述连接处，两个分开的基因组位置处的核苷酸彼此直接相邻；用限制性酶消化所述多个eccDNA分子以形成一组线性化DNA分子，其各自包括所述连接处；以及对于所述一组线性化DNA分子中的每一个：对所述一组线性化DNA分子的至少两个末端进行测序以获得一个或多个序列读取。19.方法，其包括：接收有机体的生物样品，所述生物样品包括多个染色体外环状DNA(eccDNA)分子，其中所述多个eccDNA分子中的每一个包括连接处，在所述连接处，两个分开的基因组位置处的核苷酸彼此直接相邻；使用转座酶切割所述多个eccDNA分子；使用所述转座酶将适配子序列连接至所述多个eccDNA分子中每一个的两个切割末端，从而形成一组线性化DNA分子，其各自包括所述连接处和所述适配子序列；以及
对于所述一组线性化DNA分子中的每一个：对所述一组线性化DNA分子的至少两个末端进行测序以获得一个或多个序列读取。20.如权利要求18或权利要求19中的一项所述的方法，其中，对于所述线性化DNA分子中的每一个，所述一个或多个序列读取包括所述连接处。21.如权利要求18或权利要求19中的一项所述的方法，其还包括：对于所述线性化DNA分子中的每一个：从所述一个或多个序列读取中选择所述线性化DNA分子的一对末端序列，所述一对末端序列不包括所述适配子序列或所述连接处；反转所述一对末端序列中的每一个的方向以获得一对反向末端序列；以及将所述一对反向末端序列映射到参考基因组；以及分析映射的反向末端序列以测量所述生物样品的特性。22.如权利要求21所述的方法，其还包括：基于映射到所述参考基因组的一对反向末端序列将所述线性化DNA分子鉴定为源自eccDNA分子；以及确定一组多个eccDNA分子的集合值，其中分析所述映射的反向末端序列以测量使用所述集合值的生物样品的特性。23.如权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述eccDNA分子是无细胞的。24.方法，其包括：接收有机体的生物样品，所述生物样品包括无细胞DNA，所述无细胞DNA包括线性线粒体DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜明，赵慧君，陈君赐，江培勇，吉璐，冼子君，张海强，邓佳恩，
申请(专利权)人：格里尔公司，
类型：发明
国别省市：